付 俊，彭颖冰，王林泠，李竟才，李世升

(1. 湖北省经济林木种质改良重点实验室，大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，黄冈师范学院生物与农业资源学院，湖北 黄冈 438000;2,湖北省中科产业技术研究院, 湖北 黄冈 438000)

萝卜(RaphanussativusL.)属十字花科萝卜属一年或两年生植物，别名莱菔，以肉质根为主要食用部分。萝卜既可鲜食，又可加工，且耐贮运，是我国重要的根菜类蔬菜，在世界各地广泛栽培。萝卜属低温长日照类型，早春种植的萝卜因低温春化影响，较快开始花芽分化，出现先期抽薹开花的问题，也称早花或未熟早花[1]。早期抽薹后导致萝卜肉质根生长不充分，严重影响其产量、营养和商品品质等。先期抽薹已成为萝卜生产中的一个重要问题[2]，因此研究萝卜早薹机制并找到应对策略迫在眉睫。刘可群等[3]据萝卜生长期对低温春化的反应特点建立了萝卜抽薹生育期的数学模型，该模型可以很好地预测萝卜的抽薹期，从而可以用于指导萝卜的栽培生产。王淑芬等[4]对萝卜抽薹过程中GA3和IAA含量的测定结果表明，GA3在抽薹前夕有一个明显的高峰，而IAA含量在花芽分化及抽薹时明显增加。宋贤勇等[5]研究发现，在现蕾抽薹过程中多种激素的平衡比单一激素对萝卜抽薹开花的影响更大。另外有学者发现不同萝卜品种对环境的适应能力不同，而且不同萝卜品种在从播种到现蕾、抽薹和开花所需的时间以及所需的适宜低温处理条件(温度、处理时间)等均有显著差异[6]。汪炳良等[7]发现从播种至现蕾、抽薹和开花所需的时间不仅在品种间和播种期之间存在显著差异，且品种与播种期之间的互作效应也达到极显著水平。许园园等[8]采用电子克隆与基因组步移(Genomewalking)策略分离出萝卜Rs-FPF1基因gDNA和cDNA及启动子序列，进一步证明了Rs-FPF1基因能够促进萝卜提早开花。YI等[9]利用从头组装的转录组策略在萝卜中分离了3个FLC的同源基因RsFLC1，RsFLC2和RsFLC3。这3个FLC基因在非春化的植物中高表达，且被春化作用所抑制。在拟南芥中表达这3个FLC基因可以显著延迟开花，证明其可能起着开花抑制子的功能。王夏等[10]通过构建萝卜抽薹开花相关基因的cDNA文库，获得了大量的EST序列，并进行了FLC、FT、LFY等关键基因在萝卜EST序列中同源片段的克隆，并在萝卜抽薹的表观遗传学研究方面也有了新的发现。宋贤勇[11]进一步发现在萝卜未现蕾-现蕾-抽薹过程中基因组DNA甲基化水平先降低，随着花茎的伸长又逐渐上升，在各个时期的CCGG内侧胞嘧啶完全甲基化程度均高于半甲基化的程度。

“黄州萝卜”是湖北省黄冈市具有浓厚地方特色的常规萝卜品种，有着悠久的种植历史,因其有着“生食甜，熟食香，腌食脆，冬藏春食好煨汤”等优点深受广大民众欢迎[12-13]。2008年8月，“黄州萝卜”正式成为国家地理标志保护产品[12]；2011年被评为湖北省名优蔬菜,成黄冈市蔬菜产业的一张名片[13]。近年来由于长期自交, 品种自身甚出现退化现象，其中就表现出了“黄州萝卜”提早抽薹开花的问题。“黄州萝卜”早花问题极大限制了其巨大社会经济效益和生态效益的发挥。因此开展“黄州萝卜”早花特性调查及应对措施研究尤为重要。

本文以具有浓郁地方特色的湖北黄冈地标产品“黄州萝卜”为研究对象，通过实地调查及基因表达检测等方式力图揭示其早苔机制并提出应对措施。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为黄州萝卜和春萝卜(中萝一号来自中国农科院南方经济作物研究所梅时勇研究员提供的耐薹晚开花的萝卜商品种)，均来自黄冈师范学院大别山生物资源库，于2019年2月1日，2019年4月10日，2019年6月10日及9月1日分四批种植于黄冈师范学院实验田。

1.2 试验方法

1.2.1田间调查

待田间植物抽薹后，观察田间植株的抽薹情况，编号并作好调查结果记录。

1.2.2总RNA的提取、质量检测及cDNA合成

采用TiangenRNA抽提试剂盒分别提取黄州萝卜和春萝卜生长点处组织的总RNA。取2μL的总RNA在1%的琼脂糖凝胶上电泳，检测其质量和完整性。通过M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)将提取好的总RNA反转录合成cDNA。

1.2.3引物序列

本实验一共涉及20个开花相关的基因(来自NCBI数据库)及内参基因Actin引物，供定量PCR检测相关基因表达量之用，各基因引物经Primer 3设计，各基因引物序列详见表1，引物由金斯瑞公司合成。

1.2.4基因表达量定量检测

以萝卜Actin2/7 US (5’-GCATCACACTTTCTACAAC-3’) and UAS (5’-CCTGGATAGCAACAT CAT -3’)作为内参，在ABI7500定量PCR仪中开展上述20个基因的表达量定量分析。基于2×SYBR Green定量PCR Master的定量PCR反应体系为95 ℃变性15 s和 60 ℃延伸40 s共40个循环。

表1 表1用于定量PCR的20对引物Tab. 1 20 Pairs of Primers for quantitative PCR

2 结果与分析

2.1 不同时间批次萝卜抽薹情况调查结果分析

据实际调查发现，全年四个时间批次的萝卜种植过程中，因低温因素(表2)导致第一批(2019年2月)和第二批(2019年4月)黄州萝卜均出现提前抽薹情况，而剩下两批次(2019年6月和2019年9月)均未出现提前抽薹情况。相比之下，春萝卜在全年四个批次的种植过程中均未出现提前抽薹情况，仅在第一批次种植过程中春萝卜有部分在肉质根膨大完全，已经完全成熟的较晚时期抽薹。图1是第一批次在田间观察到的生长早期两组萝卜品种的抽薹情况，图1(a)是春萝卜，植株整体长势较低矮，且均未抽薹，叶片普遍较长，宽大。图1(b)是黄州萝卜，植株整体长势较高，绝大部分植株都已抽薹，叶片普遍较短且细小。

表2 2019年3月至11月期间各月环境温度统计表Tab. 2 Environment temperature on each month during plant period

图1 萝卜抽薹情况调查结果图(a)尚未抽薹的春萝卜;(b)已经抽薹的黄州萝卜Fig.1 Observation results of bolting of radish (a) radish cultivar without bolting;(b) bolted Huangzhou radish

经对上述两萝卜品种在第一批次(2019年2月)种植后待肉质根膨大早期的抽薹率进行统计，两个品种的抽薹率统计结果图2。由图2可见两萝卜品种的抽薹率差异显著，其中春萝卜植株无一抽薹，抽薹率为0%，黄州萝卜都已抽薹，抽薹率为100%。

图2 两品种抽薹率统计结果Fig.2 Statistical results of bolting rate of two cultivar

2.2 两种萝卜开花后肉质根对比结果

图3所示春萝卜及黄州萝卜在开花后肉质根的比较情况，通过比较发现尽管有部分春萝卜在晚期抽薹，春萝卜肉质根却已明显膨大，肉质根生长饱满且肥硕图3(B～D)；与之相反，抽薹已久的黄州萝卜肉质根十分细小，肉质根未明显膨大图3(A)。从植株的开花情况可以看出，黄州萝卜的的主薹生长充分，具有一定高度，且抽薹分枝数与右侧的春萝卜相比茂密很多，右侧春萝卜基生叶较黄州萝卜显著增多，主薹较矮小，主薹分枝数较少。

图3 同一时期萝卜开花后肉质根比较图片(A为黄州萝卜，B～D分别为同一时期开花情况不同的春萝卜)Fig.3 Comparison of taproots of radish after flowering during in the same period(A.Huangzhou radish; B～D.Different flowering performance other radish cultivar during the same development stage)

2.3 定量PCR检测结果及数据分析

对两种萝卜开花相关基因表达量进行比较，从图4中不难发现FLC[9, 14]、FT[15]、FR1[15]、SVPX[15]、CO[15]、AP1XM[15]、AP1XM2及SCAR1(LOC108806645)等8个基因在春萝卜和黄州萝卜中表达量差异十分显著。其中FLC基因在黄州萝卜中低表达，FT基因在黄州萝卜中表达量相对春萝卜较高，上述结果与涉及经典成花途径调控的FLC抑制FT基因表达，导致FLC和FT表达量完全相反[9，14，15]的情况完全一致。此外SVPX、FR1、CO和SCARS三个基因都是在黄州萝卜的表达情况高于春萝卜，仅有AP1XM两个同源基因在黄州萝卜中的表达量明显低于春萝卜。

因此，初步推测FT、FR1、SVPX、CO、SCARS这三类基因可能对黄州萝卜抽薹过程有促进作用，而FLC和AP1XM(RsAP1XM和RsAP1XM2)两类基因可能对黄州萝卜抽薹有抑制作用。

图4 开花相关基因表达量比较Fig.4 Comparison on expression level of flowering relative genes between two cultivar in radish

本研究通过对黄州萝卜和春萝卜(中萝一号)两种类型萝卜在田间不同种植时间批次的抽薹情况和开花后肉质根膨大情况进行对比观察，进一步在上述两萝卜品种内分析开花相关基因的表达量差异，研究发现：黄州萝卜容易受低温春化等因素影响导致提前抽薹，最终影响肉质根形态及产量均差于耐抽薹的春萝卜品种；经基因表达量差异分析，初步找到开花相关基因的差异表达可能是黄州萝卜容易受低温春化等因素影响而提前抽薹开花原因。

黄州萝卜在低温春化作用下极易抽薹开花，其对温度敏感性强于春萝卜，阻碍其常年栽培，限制其经济价值的充分体现。FLC直接抑制成花素基因FT和FD表达，从而防止植物在过冬前或越冬时开花。冬季低温通过“春化路径”抑制FLC基因表达。来年春季，随着温度升高以及日照变长，“光周期路径” 激活FT表达，FT和FD形成异源蛋白二聚体直接调控花发育基因，从而促进开花[16-17]。本研究发现黄州萝卜中在低温条件下FLC基因表达量极低，本应被抑制的FT基因反而大量表达，该基因表达的差异是黄州萝卜不耐抽薹而表现提前开花的主要原因。

因此，为避免因黄州萝卜提前开花导致肉质根不能正常膨大形成而影响产量，建议可一方面可通过基因改造[18]，结合现在基因编辑技术抑制FT等促进黄州萝卜提前开花的基因表达，彻底改良黄州萝卜不耐抽薹而易早花的缺点；另一方面则是结合设施栽培技术帮助黄州萝卜在实际栽培过程中避免低温诱导而提前开花。