石 芸， 毛银雪， 金俊杰， 高 珣， 唐丽娟， 秦昆明,， 李伟东*

(1.南京中医药大学药学院, 南京 210023； 2.江苏海洋大学药学院, 连云港 222005； 3.南京海源中药饮片有限公司, 南京 210061)

中药材牛蒡子为菊科草本植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果实,味辛、苦,性寒,归肺、胃二经,具有疏散风热、解毒透疹、利咽消肿等功效[1],临床常需要炒制后使用。牛蒡子中主要含牛蒡苷、牛蒡苷元等木脂素类成分,以及绿原酸、异绿原酸A等酚酸类成分[2]。课题组前期研究发现[3],牛蒡子炒制之后绿原酸、牛蒡苷、异绿原酸A含量下降,异绿原酸B、异绿原酸C、牛蒡苷元含量上升。通过液质联用技术结合化学计量学方法[4],发现上述6个成分也是牛蒡子炮制前后的主要差异性成分,且具有一定的药理作用,可以作为牛蒡子炮制前后的质量标志物成分。

中药质量标志物是代表某种中药特征的标志物,其来源明确,与功效用途相关联,是反映一味中药质量特征的化合物组合,也是近年来开展中药质量控制和药效物质基础研究的一个重要方向[5]。网络药理学是区别于一般药理学的研究方法,它是以系统生物学和生物网络平衡为基础的药理学分支学科,通过多途径调节信号通路来提高药物疗效,更符合中医药的整体观,可以揭示中药“成分-靶点-疾病”之间复杂的网络关系[6]。现有研究主要针对牛蒡子炮制前后主要成分变化及药效作用的改变,尚不清楚这些发生变化的成分具有哪些药理活性。采用网络药理学方法,对牛蒡子炮制前后的质量标志物成分进行靶标预测、网络构建和分析,有助于进一步研究揭示牛蒡子炮制机理及其科学内涵。现以牛蒡子炮制前后发生变化的主要质量标志物成分为研究对象,运用网络药理学方法预测作用靶标,阐明“成分-靶点-疾病”之间的关系,为阐明牛蒡子的炮制机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

数据库与软件包括Open Bable GUI 2.4.1化合物格式转换软件、PharmMapper靶点筛选数据库、UniProt数据库中的搜索功能、蛋白质数据库PDB、网络拓扑数据分析软件Cytoscape 3.6.0、蛋白相互作用平台STRING、Metascape生物学信息注释数据库。

1.2 牛蒡子炮制前后质量标志物的选取

课题组前期对牛蒡子炮制前后主要成分进行了液质联用分析,通过化学计量学数据分析方法,结合文献数据报道[7-8],发现牛蒡苷、牛蒡苷元、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C(图1)可能是炮制前后的质量标志物成分。以这6个成分为研究对象,使用Chemical Book平台,获得各成分的mol格式文件。

图1 牛蒡子炮制前后质量标志物的化学结构

1.3 潜在作用靶点的预测

PharmMapper是一款小分子化合物药效团匹配与潜在识别靶标平台,有超过7 000个受体的药效团模型,能够基于分子相似性原理预测小分子化合物的作用靶点。本研究将各成分mol格式导入Open Bable GUI 2.4.1 软件,使用其convert功能,转换成为标准的SDF格式,将SDF格式文件导入PharmMapper在线靶点筛选平台,预测各成分作用靶点。

1.4 蛋白相互作用网络的构建

STRING数据库能够评估和整合蛋白之间的相互作用,包括蛋白与蛋白的直接和间接关联。将预测的靶点上传至STRING数据库并选择“Homo Sapiens”为分析的生物体,置信度得分设置为0.700。将得到的蛋白-蛋白相互作用数据导入 Cytoscape 3.6.0软件中构建蛋白-蛋白互作网络。利用Analyze network工具对网络进行分析,完善PPI网络图。

1.5 构建成分-靶点-疾病网络

Cytoscape是一款图形化软件,可以依据节点的网络关系构建活性成分-作用靶点网络,并对网络进行编辑和分析。根据上述化学成分-作用靶点预测结果,应用Cytoscape软件构建成化学成分-靶点-疾病(component-target-disease,C-T-D)网络模型。运用软件中Network analyer功能,进一步对网络模型中的相互关系进行分析。

1.6 生物功能与通路富集分析

以标准基因名的形式将活性成分的关键靶标基因列表导入Metascape软件,对作用靶点的GO (gene ontology)注释和KEGG通路进行富集分析,选取P值排名靠前的20条通路。GO富集分析Ontology勾选“ALL”,对Biological Process、Molecular Function、Cellular Component 3个部分进行富集,预测靶点的功能分布。

2 结果

2.1 牛蒡子质量标志物潜在靶点的预测

利用PharmMapper对牛蒡苷、牛蒡苷元、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C的潜在靶标进行筛选,然后选择Norm Fit高于0.5,共有87个靶点,其中牛蒡苷和牛蒡苷元的潜在靶标所占比例最大,这些靶点主要抗肿瘤、抗炎、心脏损伤保护、肝脏疾病治疗、抗氧化等方面发挥作用。牛蒡子主要活性成分潜在作用靶标在靶点总数中的占比情况如图2所示。将6个成分潜在作用靶点Fit值排名靠前的20个靶点信息和对应的成分列在表1中。

由表1可知,牛蒡子炮制前后质量标志物的作用靶点中,很多与抗肿瘤作用相关。如肿瘤抑制蛋白p53(Cellular tumor antigen p53)是一种由抑癌基因表达产生,具有抑制DNA 复制及细胞恶性增殖等作用的蛋白质。p53基因突变率20%～50%,突变后p53蛋白则失去阻止癌细胞增殖的作用,引起细胞恶变、转化或凋亡,并诱发异常有丝分裂,促进恶性肿瘤发生。解聚素金属蛋白酶17(ADAM 17)具有解聚素和金属蛋白酶的活性,在炎症和肿瘤组织中均具有一定的作用,与肾癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等都有着密不可分的关系[9],这与牛蒡子抗肿瘤的作用机制相一致。β-半乳糖苷凝集素4(β-galactoside-specific lectin 4)是肿瘤细胞凝集素中的一种,具有抑制体液免疫功能的作用和增强细胞免疫的作用,能够调节肿瘤细胞与基质之间、肿瘤细胞之间的黏附,并且参与肿瘤细胞的转移[10]。此外,RecA蛋白(protein recA)在修复受损DNA的过程中起到抗氧化作用,与牛蒡子抗氧化功能相关[11]。心肌细胞特异性增强因子2A(Myocyte-specific enhancer factor 2A, MEF2A)是心肌细胞特异性增强因子2(Myocyte-specific enhancer factor 2, MEF2)基因家族的成员。人类家系遗传分析表明突变的MEF2A是冠状动脉粥样硬化的致病基因之一,这一致病基因的发现为研究冠心病的发病机理,开发预防和治疗冠心病的新药具有重要价值,这一潜在靶标与牛蒡子治疗心血管疾病的功能吻合。

图2 牛蒡子炮制前后质量标志物的作用靶点分布

表1 牛蒡子炮制前后质量标志物的主要靶点信息

2.2 靶点蛋白相互作用PPI网络构建

将牛蒡子炮制前后质量标志物的关键靶点基因导入STRING数据库,在Organism中选择Homo Sapiens,得到蛋白相互作用关系可视化图。为了便于后期Cytoscape作图,对基因进行调整过滤的分值选择0.9,离散点进行隐藏,导出蛋白相互作用网络图，如图3所示。由图3可以看出,除了2个靶点外,其他均相互关联,与牛蒡子的多靶点相互作用机制相吻合。

不同蓝色圆点代表不同的靶点,代表着靶点蛋白相互之间的关系；红色和黄色圆点代表蛋白相互作用网络中的核心靶点蛋白

在上述核心靶点中,PSMD4(Proteasome 26S subunit, non-ATPase)基因编码的蛋白可以参与底物识别,从而导致目标蛋白质的选择性降解。作用于PSMD4的化合物,可以影响肝癌细胞的体外增殖和克隆[12]。RUVBL1蛋白是DNA解螺旋的关键酶,抑制该基因的表达,可以有效抑制细胞增殖和迁移,为临床治疗肺癌提供理论基础[13]。乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)是脂肪酸合成和氧化代谢途径的限速酶,研究表明ACACA在多种肿瘤中显著高表达,与肿瘤进展及患者预后密切相关[14]。由此可见,牛蒡子炮制前后质量标志物的核心作用靶点均与抗肿瘤相关,说明牛蒡子炮制后具有消肿散结功效,可用于肿瘤治疗具有一定的科学意义。

2.3 “成分-靶点-疾病”网络图的构建

选择牛蒡子炮制前后6个质量标志物成分,以及这些成分对应的靶点和靶点对应的主要疾病,运用Cytoscape软件进行作图,得到牛蒡子炮制前后质量标志物成分的“成分-靶点-疾病”网络图，如图4所示。图4中包含了疾病与靶点、靶点与成分、靶点与靶点之间的关系。

蓝色线条表示靶点与靶点、疾病与靶点之间的药效团关系；红色表示靶点与成分之间的关系

通过“成分-靶点-疾病”网络图可以看出一个靶点可能对应多个疾病,而同一个疾病可以通过多个靶点治疗达到效果。研究发现：通过牛蒡子炮制前后6个质量标志性成分筛选出的靶点,与肿瘤(tumour)、肝脏疾病(liver disease)、风湿性关节炎(arthritis)、心血管疾病(cardiovascular disease)、炎症(inflammation),糖尿病(diabetes mellitus)等疾病相关,其中,抗肿瘤是牛蒡子最主要的药理学作用,在网络中处于比较核心的位置,涉及多个作用靶点。例如,DNA拓扑异构酶I和类苏氨酸合成酶都与抗肿瘤发生相关[15]。牛蒡子炮制前后不同的质量标志物可能有相同的作用靶标。如牛蒡苷和牛蒡苷元的重复靶标有类苏氨酸合成酶(Probable threonine synthase),Acyl CoA结合域蛋白6(Acyl-CoA-binding domain-containing protein 6),胸腺细胞选择性相关高迁移率族蛋白TOX(Thymocyte selection-associated high mobility group box protein TOX),c-Ets-1蛋白(Protein C-ets-1)和蛋白unc-45同源物A(Protein unc-45 homolog A)。Acyl CoA结合域蛋白6有心肌损伤保护功能,其他4个靶标都有抗肿瘤作用。异绿原酸B和异绿原酸C重复靶标最多,有18个,这些靶标的药理学作用多为抗肿瘤,例如核孔复合体蛋白nup98-nup96(Nuclear pore complex protein Nup98-Nup96)参与调解T细胞活性,在抗肿瘤、抗炎和治疗自身免疫病(如风湿性关节炎)方面发生作用；β肾上腺素能受体激酶1(β-adrenergic receptor kinase 1)可以在胰腺癌的临床病理诊断时作为潜在标志物。由此可见,牛蒡子炮制前后主要质量标志物作用靶点多与抗肿瘤作用相关,进一步验证了前期研究发现牛蒡子炮制后抗肿瘤作用增强的研究结论。

2.4 基因功能与通路富集分析

将目标成分预测出的87个主要靶点导入Metascape平台进行GO 注释分析和KEGG pathway分析,设置阈值P<0.01,获取通路富集结果，如图5所示。通路注释分析结果显示,目标成分预测出的16条主要信号通路，如表2所示。结果显示，小分子代谢过程(small molecule catabolic process)是最显著的生物过程,该过程涉及10个作用靶点,可能是牛蒡子抗肿瘤作用最重要的生物过程。其他生物过程包括干扰素-γ应答(response to interferon-gamma)、有机磷化物生物合成过程(organophosphate biosynthetic process)、磷酸核苷代谢过程(nucleoside phosphate metabolic process)、免疫系统细胞因子信号(cytokine signaling in immune system)和α-氨基酸代谢过程(α-amino acid metabolic process)等。

图5 牛蒡子炮制前后质量标志物作用通路富集分析图

通过对相关通路进一步分析发现,嘌呤代谢(purine metabolism)有4个作用靶点参与,嘌呤代谢发生紊乱后会引起痛风性关节炎或肾炎,通过调控该条信号通路,可能是牛蒡子发挥抗炎作用的主要途径。胰岛素信号通路(insulin signaling pathway)是机体调控血糖的重要途径,该条通路发生紊乱,可以导致血糖异常,牛蒡子通过作用于该条信号通路,对血糖进行调节,与文献[16]报道牛蒡子具有调节血糖作用相一致。

3 结论

通过网络药理学方法揭示了牛蒡子炮制前后质量标志物的潜在作用靶标,利用PharmMapper对牛蒡苷、牛蒡苷元、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C的潜在靶标进行筛选,证实了牛蒡子具有抗肿瘤、抗氧化、心肌损伤保护等药理作用。如牛蒡苷元的潜在作用靶标谷胱甘肽还原酶对维持胞内高比率GSH/GSSG及植物细胞的氧化还原平衡有重要意义。绿原酸的潜在作用靶标心脏脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein, heart)是一种可溶性蛋白质,但当机体出现心肌损伤时,该蛋白的含量会显著上升,敏感性和特异性较高,这就验证了牛蒡子治疗心血管疾病的作用。异绿原酸B潜在作用靶标刺猬蛋白(protein hedgehog, HH)不仅与胚胎的生长发育、成人组织再生以及修复相关,而且与多种肿瘤的发生和转移有相关性,这就为牛蒡子的抗肿瘤作用提供依据。

牛蒡子通过加热炒制后减少其寒凉成分,缓和药性,从而突出其抗炎、抗肿瘤等方面的作用。研究揭示了牛蒡子炮制后主要质量标志物都具有抗肿瘤作用,且主要作用靶标与牛蒡子的潜在药理活性是具有相关性的,也在一定程度上验证了中药的传统的功效。通过对潜在靶标以及“成分-靶点-疾病”网络的研究可以看出,牛蒡子炮制前后质量标志物中不同成分的作用靶点各不相同,但不同的信号通路存在相互联系。同时,研究也进一步揭示了,牛蒡子炮制前后功效改变与这6个质量标志物成分的作用密切相关。在下一步的研究中,将应用传统药理学方法,对牛蒡子炮制前后不同组合的质量标志物进行药效学验证,从而进一步阐明牛蒡子炮制机理。

表2 牛蒡子炮制前后质量标志物的相关通路信息