液相色谱-串联质谱法检测食品中罗丹明B的残留量

2020-12-14白旭东孙晓娟谷岩

品牌与标准化 2020年5期

白旭东孙晓娟谷岩

【摘要】目的：建立食品中罗丹明B的液相色谱-电喷雾质谱检测方法（UPLC-ESI-MS/MS）。方法：样品经酸化乙腈提取，正己烷去脂后，经固相萃取小柱（MCX）净化，富集后采用液相色谱-电喷雾质谱进行检测，以正离子多反应监测模式测定，外标定量。结果：罗丹明的线性范围为2-50 ng/mL，加标回收率为90.0%～110.0%，相对标准偏差小于10.0%（n=6）;方法检出限为1 ?g/kg。结论：该方法快速、准确、灵敏，适合用于食品中罗丹明B的确证检测。

【关键词】罗丹明B;液相色谱串联质谱仪;固相萃取;食品;残留量

【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2020.05.022

Determination of Rhodamine B Residues in Feed by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

BAI Xu-dong，SUN Xiao-juan，GU Yan

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China）

Abstract： Objective To establish an analytical method for the detection of rhodamine B residues in feed. Methods After the samples were extracted by acidified acetonitrile，it was purified by solid phase extraction cartridge（MCX）after removal of fat，after enrichment，it was detected by a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）. The positive electrospray ionization（ESI+）mode and multiple reactions monitoring（MRM）were adopted to detect，external standard method was used for quantitative determination. Results The linear range of rhodamine B was 2.0-50 ng/mL. The average recoveries of rhodamine B from spiked sample at three concentration levels were between 90% and110% with RSD（n=6），the relative standard deviations（RSDs）were less than 10%（n=6）. The limits of quantitation（LOD）were 1 ?g/kg. Conclusion The proposed method is fast，accurate and sensitive，which is suitable for detecting rhodamine B in feed samples.

Key words： Rhodamine B;liquid chromatography tandem mass spectrometer;solid phase extraction;food;residues

羅丹明B（rhodamine B，RhB），又称玫瑰红B，俗称花粉红[1]。罗丹明B是以氧杂蒽为母体的碱性咕吨染料，具有特殊的结构及荧光特性，是常用的荧光分析试剂，是用于腈纶、造纸、油漆、钢铁、矿业等领域的工业染料，罗丹明B具有潜在的致癌、致畸和致突变作用[2-3]，日本及欧美等国家和地区均已禁止用于食品加工中，中国卫生部也将其列在《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》中，禁止在食品中使用。由于罗丹明B价格低廉、色彩绚丽、稳定性强，仍有部分不法商贩为了牟取暴利，违法将其加入到辣椒油、辣椒酱等调味品中，因此，建立食品中罗丹明B的检测方法，有助于控制工业染料在食品中的滥用，应对突发的食品安全事件。

罗丹明B目前的主要检测方式是高效液相色谱法[4-6]、液相色谱-质谱联用法[7-10]、荧光探针法[11]、免疫检测法[12]等，主要样品的前处理方式是液-液萃取法[7]、固相萃取法[9]、微波辅助萃取法[13]、QuEChERS[14]以及凝胶渗透色谱净化法[8，15]。

本文采用酸化乙腈提取样品，经固相萃取柱进行净化，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，方法灵敏度高，准确度高，适合于多种食品中罗丹明B的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TQD型三重四级杆质谱仪（沃特斯公司，配有电喷雾离子源）;氮吹仪（屹尧公司）;离心机（美国日立公司）。

罗丹明B（购于德国DR.公司）。

乙腈、甲醇、正己烷和冰醋酸（色谱纯，Fisher公司）;乙酸铵（分析纯，国药集团）;MCX固相萃取柱（6 mL，150 mg，Waters公司）;实验室用水为Milli-Q超纯水。

样品为市售。

1.2 试验方法

1.2.1 标准储备液的配制

标准储备溶液配制：精密称取罗丹明B适量，用甲醇溶解，分别将待测物质配制成0.5 mg/mL的储备溶液。

1.2.2 样品制备

将样品混匀，精密称取2.00 g于50 mL离心管中，加入10 mL2%的酸化乙腈，涡旋2 min，超声10 min，水平震荡10 min（速度200 Moti/min），在-10 ℃下10000 rpm離心8 min;转移上清液于另一离心管中，加入5 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋2 min，在5000 rpm离心5 min，弃去正己烷层（重复3遍），乙腈层于氮气流下吹至近干，加入5 mL2%甲酸溶液，涡旋混合30 s，在-10 ℃下4300 rpm离心5 min，上清液经MCX 6cc 150 mg固相萃取柱（6 mL5%甲醇氨，6 mL甲醇，6 mL水，6 mL2%甲酸溶液依次活化）纯化，先后用5 mL甲醇和5 ml5%甲醇淋洗，抽干，6 mL5%甲醇氨洗脱，洗脱液在65 ℃水浴中用氮气吹干，加入5 mL10%乙腈溶解残渣，用0.22 m的滤膜，过滤，作为样品溶液。

1.2.3 仪器条件

1）色谱条件

色谱柱：a）色谱柱：waters C18柱，100×2.1 mm，粒径1.7 ?m;b）流速：0.3 mL/min;c）柱温：35 ℃;d）进样量：5 μL;e）流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，洗脱梯度：0～2.0 min，90%～40% A;2.0～4.0 min，40% A;4.0～4.5min，40%～90% A;4.5～7 min，90% A。

2）质谱条件

质谱条件：a）电离方式：电喷雾正离子模式;b）检测方式：多反应检测（MRM）;c）雾化气压力：30 psi;d）离子喷雾电压：3500 V;e）干燥气温度：330 ℃;f）干燥气流速：11 L/min;g）*：定量离子。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

首先将0.5 ?g/mL的待测化合物的标准溶液分别以流动注射的方式在正离子模式下进行母离子全扫描，确定分子离子，然后对其子离子进行全扫描，优化碰撞能量等参数得到罗丹明B的最佳质谱条件，罗丹明B检测参数见表1。

2.2 样品提取和净化方式的选择

2.2.1 样品提取溶液的种类和体积选择

罗丹明B为碱性物质，易溶于水。研究了酸化甲醇-水、酸化乙腈-水体系的萃取效率，对含油脂较少的样品，发现有机溶剂比例增加时，回收率没有明显的变化，当样品中油脂含量较高时，加入有机溶剂回收率明显提高，随着有机溶剂比例的增加，色素等物质在萃取液中明显减少，沉淀蛋白作用也很显著，当提取溶剂2%酸化乙腈时，提取溶剂只需要10 mL，调味油、炒货和腊肠样品的提取回收率最高，离心后，可以去除大部分的油脂和蛋白，同时，对于色素含量较高的辣椒面、辣椒酱等样品，随着乙腈的比例增加，色素的提取率降低，干扰较少，因此文本选择了2%酸化乙腈，体积为10 mL作为提取溶剂。

2.2.2 除去脂肪、油脂的方法的选择

对于调味油、腊肠和炒货的样品，油脂、脂肪含量较高，酸化乙腈也会提取出一部分，为了更好的延长色谱柱的使用寿命，保护好仪器，进一步去除油脂十分必要，本文考察了乙腈饱和的正己烷和石油醚去除油脂的效率，实验结果表明，加入5 mL乙腈饱和的正己烷，重复提取2遍后，第3遍正己烷层已经变为无色，因此本方法采用5 mL乙腈饱和的正己烷萃取3遍来去除油脂和脂肪。

2.2.3 固相萃取柱的选择

本文分别考察了HLB、MAX、C18和MCX的固相萃取小柱，提取回收率四种类型的柱子结果相差不大，但是采用MCX小柱净化后的样品，基质效应较小，因此，本文选择了MCX小柱进行样品净化。

2.2.4 样品基质效应的消除

大气压喷雾电离离子源（ESI）容易受样品基质的影响。基质是样品中被测物以外的组分，常对被测物分析有显著的干扰，并影响测定结果的准确性，这些干扰和影响被称为基质效应。基质效应表现为离子抑制或离子增强。本文所涉及的样品较为复杂，特别是调味油、腊肠和炒货等样品，基质较为复杂，随着最终的定容体积的增加，基质效应不断降低，由于罗丹明B在质谱上灵敏度较高，因此，最终选择定容体积为5 mL，来消除基质效应，必要时，复杂基质可以采用基质空白配制标准曲线，进一步消除基质效应。

2.3 方法的线性范围及检出限

用10%乙腈将罗丹明B配制成浓度为2、4、10、20和50 ng/mL的系列标准溶液。按照“1.2.3 仪器条件”进行检测，以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明罗丹明B在2～50 ng/mL范围内线性关系良好，可满足样品的定量分析的需要。检出限和定量限的配制采用基质空白溶液，检出限（以3倍信噪比（S/N=3）计）及定量限（以10倍信噪比（S/N=10）计）见表2。

2.4 回收率及精密度实验

以空白基质为样品，在5、10和50 ?g/kg三个水平下进行加标回收实验，平行测定6个样品，计算加标回收率。结果见表3。

2.5 实际样品测定

应用本法测定了10批调味油，10批火锅底料，10批炒货，5批腊肠，均未检出罗丹明B。

3 结论

本文所建立的方法快速、准确、简单，可对多类食品中的罗丹明B准确定量，经方法学验证，能够满足检测技术要求，可以为检验人员提供检测依据，同时可为监管进行服务。

【参考文献】

[1] 卢士英，邹明强.食品中常见的非食用色素的危害与检测[J].中国仪器仪表，2009（8）：45-50.

[2] 陈艳美，于淼.罗丹明B染色食品对人体的危害及检测[J].科学之友，2011（18）：153.

[3] Moosavi F，Mohabatkar H，Mohsenzadeh S. Computer-aided analysis of structural properties and epitopes of Iranian HPV-16 E7 oncoprotein[J].Interdiscip Sci，2010（4）：367-372.

[4] 李小平，潘胜东，赵永纲.固相萃取-高效液相色谱荧光法同时测定辣椒面中罗丹明B和罗丹明123[J].中国卫生检验杂志，2012（8）：1766-1769.

[5] 咸瑞卿，高文超，王小兵，等.调味品中罗丹明B的HPLC-FLDDAD测定方法研究[J].中国调味品，2013（8）：109-112.

[6] 占立明，夏爱萍，张旭，等.高效液相色谱法测定辣椒粉中罗丹明B的含量[J].农业机械，2012（36）：107-109.

[7] 周鹏，余清，林钦，等.液质联用法测定辣椒红色素中罗丹明B含量[J].食品研究与开发，2013（4）：74-77.

[8] 赵珊，张晶，丁晓静，等.凝胶净化/超高效液相色谱电喷雾质谱法检测调味油中11种禁用偶氮染料及罗丹明B[J].分析测试学报，2012（4）：448-452.

[9] 乔勇，韩芷玲，刘媛，等.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定食用调味油中的罗丹明B[J].理化检验（化学分册），2013（7）：844-847.

[10] 张东雷，汪丽娜，，陈小珍，等.超快速液相色谱-离子阱飞行时间质谱法测定肉制品中10种碱性染料[J].色谱，2012（8）：770-776.

[11] 梁宇，黄世江，王超海，等.荧光探针法快速检测果汁中罗丹明B残留量[J].食品科学，2012（18）：258-260.

[12] 宋珊珊.食品中罗丹明B的残留免疫检测方法研究[D].无锡：江南大学，2011：3-6.

[13] 刘宏华，张利康，武炜，等.微波萃取-凝胶渗透色谱-超快速液相色谱-串联质谱法检测腌猪肉中的罗丹明B残留[J].肉类研究，2012（5）：30-33.

[14] 曾凯，罗明标，唐俊，等.改进QuEChERS-液质联用法测定食品中6种非食用色素[J].肉类研究，2012（5）：30-33.

[15] 进出口食品中罗丹明犅的檢测方法：SN/T 2430-2010[S].