王威丽，宋沧桑，张 阳，宋文彬，毛盼盼

(1.昆明市第一人民医院药学部，云南 昆明 650000; 2.大理大学药学院，云南 大理 671000)

华法林是香豆素类抗凝血药的主要代表药品[1]。因具有充足的循证医学证据、确切的治疗效果以及低廉的价格，华法林已被广泛应用于临床抗凝治疗中。前期的研究结果表明，华法林不但能有效地降低心房颤动患者脑卒中发生率，而且使心肌梗死所导致的死亡风险降低约24%[2]。然而，由于华法林狭窄的治疗范围、较高的出血风险以及药物反应的个体差异，至今该药的使用仍然困扰着许多临床医师。近年来，随着医学的不断进步以及药物基因组学的日益完善，基础医学对于药物代谢的探索一步步走向精准化，越来越多的药物代谢机制可通过基因组学进行解释。临床研究结果已证实，华法林相关蛋白多态性与其个体间维持剂量的差异、疗效以及不良反应关系密切。采用药物基因组学来解释华法林抗凝作用的有效性及安全性是目前临床研究的新兴领域[3]。因此，本文详细地综述了华法林相关基因多态性以及临床应用等方面，为今后华法林的个体化抗凝治疗提供理论基础。

1 华法林的作用机制与药动学

血栓的形成是一种渐进的过程，需多种凝血因子的共同参与。体内含谷氨酸残基的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C、S、Z均需通过γ-谷氨酰基羧化酶(gamma glutamyl carboxylase，GGCX)进行γ-羧化，使得无活性的凝血因子被激活[4]。氢醌型维生素K(reduced vitamine K,VitKH2)是GGCX必不可少的辅助因子。在羧化的过程中，VitKH2可被氧化成环氧型维生素K(oxidized vitamine K，VitKO)，但在维生素K环氧化物还原酶复合物(vitamin K epoxide reductase complex，VKORC)以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的催化作用下，VitKO又可被还原为VitKH2[5]。抗凝血药华法林可竞争性地与VKORC结合，阻碍VitKO的还原，使得凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及蛋白C、S、Z只能在没有活性的前体阶段停留，从而发挥其较强的抗凝活性，见图1[6]。但是，这一过程并不能影响已经活化的凝血因子，所以华法林并不具有体外抗凝作用[7]。

图1 华法林的作用机制Fig 1 Mechanism of Warfarin

华法林是一种消旋体混合物，由R-华法林和S-华法林2种光学同分异构体构成，S-华法林的药理活性强于R-华法林(约3～5倍)，其中85%以上的S-华法林主要经CYP2C9代谢[8]。据报道，华法林的生物利用度较高，口服给药后24 h可在血浆中被检测出来，72～96 h达到血药浓度的峰值。其在血液循环的过程中与血浆蛋白结合率高达98%～99%[9]。该药的消除半衰期(t1/2β)为44～60 h，因此，口服3 d后其抗凝疗效才能发挥至最佳[10]。但值得注意的是，患者服用华法林后，凝血因子Ⅶ由于半衰期较短在体内消除很快，因此，早期(24～48 h)测定的国际标准化比值(international normalized ratio，INR)并不能真实地反应患者的抗栓情况，而是反应体内凝血因子Ⅶ含量的主要表达[11]。另外，Schindler等[12]经研究也发现，华法林可通过胎盘屏障，胎儿血浆中的华法林浓度与母体较为接近，但从母乳中并没有发现活性华法林的存在。因此，妊娠期妇女禁止服用华法林，但哺乳期妇女服用该药则相对安全。

2 华法林的基因多态性

2.1 CYP2C9基因多态性

CYP2C9是华法林在肝代谢中最重要的酶之一，编码该酶的CYP2C9基因具有高度的多态性，其多态性主要取决于编码区的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)[13]。迄今为止，已经发现了58种可改变代谢酶结构、影响代谢酶活性，最终导致华法林代谢能力发生改变的SNP，分别以CYP2C9*1—CYP2C9*58进行命名，其中研究最广泛的2种等位基因是CYP2C9*2和CYP2C9*3[14]。据报道，若上述2种等位基因发生突变，则会增加整个治疗过程中的出血风险，特别是刚开始使用华法林治疗时的前3～6个月，其出血风险约为野生型的1.18倍，若长期使用华法林治疗，患者的出血风险还会持续增加[15]。越来越多的证明强调，CYP2C9*1是最常见的野生型等位基因，酶代谢活性正常；携带突变型CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因患者的酶活性明显低于携带CYP2C9*1的个体，即与正常代谢者相比，携带突变型等位基因的人群对华法林更加敏感，过度抗凝和出血的风险更高，达到同等抗凝水平时所需华法林的剂量更低[16-17]。CYP2C9*2等位基因在亚洲人群中几乎很少出现，但在高加索人群中，其突变的频率较高，可达12%；亚洲人群主要发现的是CYP2C9*3突变体，突变频率约为1%～4%[18]。

2.2 VKORC1基因多态性

1974年首次发现的维生素K环氧化物还原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR)，是维生素K代谢循环中的限速酶，也是华法林发挥抗凝作用的靶点酶，该酶的活性将直接影响华法林的抗栓水平[19]。2004年，VKOR编码的基因VKORC1被进一步证实，该基因上存在多个SNP位点，包括VKORCl-1639(G>A)、VKORCl-1173(C>T)和VKORCl-3730(G>A)等，其中VKORCl-1639(G>A)是影响华法林剂量的核心位点[20]。研究结果发现，携带GG、GA基因型的患者所需华法林的维持剂量分别是携带AA基因型患者的1.7、2.4倍[21]。也就是说，与携带突变纯合基因型(AA)的患者相比，VKORC1-1639 GA和GG型携带者INR达标时间相对要长，且INR达到目标范围时所需华法林的总量也较高。由此说明，患者所需华法林的维持剂量与其携带G等位基因成正相关[22]。且该等位基因在不同种族间分布频率有所不同，亚洲人群的突变频率比较高，VKORCl-1639 AA、GA和GG基因型频率分别为80.4%、18.3%和1.3%，而VKORCl-1639 AA(16.3%)、GA(48.9%)、GG(36.7%)基因型在高加索人群中也很常见[23]。

2.3 CYP4F2基因多态性

CYP4F2是一种维生素K环氧化物酶，参与维生素K的肝脏代谢，是影响华法林药效学的另一种重要遗传因素[24]。有研究报道，CYP4F2通过羟基化维生素K的苯基基团，使还原型维生素K生成减少，从而抑制凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ)的合成，发挥抗凝作用[25]。若CYP4F2基因位点19p13.12发生突变，将会削弱体内维生素K氧化酶活性，导致还原型维生素K浓度相对增加，进而影响患者对华法林剂量的需求[26]。一项回顾性研究结果表明，携带CC基因型的患者每日处方中华法林剂量显著低于携带CT/TT基因型的患者(TT型>CT型>CC型)[27]。也就是说，携带CYP4F2突变基因的人群需增加华法林的使用剂量才能达到相同的抗凝效果。随后，熊筱伟等[28]进一步研究发现，在初始采用华法林治疗的7 d内，与携带CT/TT基因型的患者相比，CYP4F2 CC基因型携带者所需华法林的维持剂量更低，进入INR目标范围所需时间更短，且受到其他因素的影响更小。总而言之，携带CC基因型的患者对华法林的抗栓治疗具有较高的敏感性。

2.4 GGCX基因多态性

GGCX为维生素K依赖性羧化酶，常表达在粗面内质网及高尔基体上，通过羧化维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ上的γ-谷氨酸残基，促进功能性凝血因子的激活，从而产生凝血作用。临床研究结果表明，华法林可直接抑制还原型维生素K的再生，阻止凝血因子的生物合成，进而发挥抗凝疗效[29]。迄今为止，已知的SNP位点中，GGCX rs12714145(3261G>A)、rs11676382(12970C>G)和rs69964(974G>A)可能与华法林的稳定剂量相关[30]。黄盛文等[31]的研究结果发现，携带GGCX(rs12714145)GG基因型的群体所需华法林剂量显著低于AA基因型的携带者。但在另一项研究中，其结果却与之相反[32]。此外，仍有报道表明，与携带CC基因型的患者相比，具有GGCX(rs11676382)G等位基因(GG/GC)的患者所需华法林的日处方量更低；同时，GGCX基因rs12714145和rs69964 2个多态性位点可能并不是影响华法林维持剂量的重要性决定因素[33]。总而言之，目前GGCX基因多态性的作用对我国人群的影响尚缺乏统一的观点。这可能是由于缺乏重视度，研究较少所造成的，需精心设计大规模的前瞻性临床试验，进一步证实其中的关联。

2.5 载脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)基因多态性

APOE是血浆脂蛋白的重要组成部分，可将在小肠内吸收的维生素K转运至肝脏中再经受体介导内吞作用进行清除。位于19号染色体上的APOE存在着E2、E3、E4 3种常见的等位基因，分别由E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4和E4/E4 6种表型构成。其中，亚洲人群的APOE基因型多为E3/E3(野生型)[34]。研究结果表明，携带E4等位基因患者的脂蛋白在肝脏中的吸收速度相对较快，继而促进了维生素K对凝血因子的羧化反应，需适当提高华法林的维持剂量才能更好发挥其抗栓水平。但与VKORC1和CYP2C9基因相比，APOE基因多态性对华法林剂量的影响相对较小[35]。李佳佳等[36]也在后续的研究中进一步证实了这一观点。由此可见，该基因多态性并非影响华法林药效学的主要原因。

2.6 其他基因多态性

近年来，内质网伴侣蛋白基因(calumenin gene，CALU)以及环氧化物水解酶1基因(epoxide hydrolase 1，EPHXl)对华法林药效学的影响同样受到了科学家的广泛关注。药物遗传学研究结果表明，CALU在维生素K循环途径中对VKOR1和GGCX具有抑制作用，进而影响了华法林的抗栓效果。在众多的SNP位点中，CALU rs339097(C>T)、CALU rs2307040(G>A)和CALU rs2290228(C>T)与华法林的治疗剂量间存在显著的相关性。若CALU基因发生突变，将会降低抑制GGCX活性的能力，导致患者对华法林剂量的需求发生改变[37]。但另一项研究结果发现，EPHXl可能是VKORC1的亚单位，在VitKO向VitKH2的转化过程中发挥着至关重要的作用[38]。综上所述，CALU与EPHXl基因多态性在华法林的临床实践中存在一定的指导意义。

3 华法林基因多态性的临床应用

过去的20年，药物基因组学在遗传领域取得了飞跃的进步。大量研究结果已经证实，华法林相关基因多态性是影响其治疗剂量的主要因素之一。2007年8月，美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)修改了华法林的药品说明书，添加了药物遗传学信息，以反映CYP2C9/VKORC1基因多态性对剂量要求的潜在影响，推荐携带CYP2C9*2/*3或VKORC1-1639 G>A等位基因的患者可采用较低的起始剂量。然而，上述更新并没有提供任何具体的遗传学相关的推荐剂量，引起了许多医师的热议与争论。因此，2010年1月FDA进一步修订了标签，添加了根据基因分型选择华法林初始剂量的简明剂量推荐表(见表1)，也再次强调了基因多态性对于华法林剂量影响的重要性[39]。

表1 FDA建议的基因多态性与华法林初始剂量对照表(mg/d)Tab 1 Comparison of FDA-recommended gene polymorphism with initial dose of Warfarin(mg/d)

目前，国内外对于华法林稳定剂量预测模型的研究较多，比较经典的有国际华法林遗传药理学协会(international warfarin pharmacogenetics consortium，IWPC)构建的适用于美国人群和欧洲人群的模型[40]以及Huang等[41]构建的适用于我国人群的模型。IWPC提出的华法林预测模型研究，共纳入了来自四大洲多个种族的4 043例患者，是迄今为止有关华法林预测模型样本量最大的研究。但由于国内外人种、体质、地区等均存在较大差异，故能否适合于我国人群尚不可知。为此，国内许多学者进行了探索。刘俊等[42]对比分析了IWPC预测模型，认为IWPC对我国汉族人群华法林稳定剂量的预测效果有限。随后，Huang等[41]提出了适合我国人群的预测模型，表明该模型可准确预测出>60%的汉族患者华法林稳定剂量。近期，又有学者对比了IWPC[40]和Huang等[41]几种预测模型，发现IWPC预测模型对我国患者人群有较好的预测作用，对提高华法林抗凝治疗的安全性和有效性具有潜在的临床意义[43]。总之，到目前为止，我国对于华法林稳定剂量的预测模型尚缺乏统一观点，因此，期待未来国内学者可以提出最适合我国人群的华法林预测模型，为患者带来福音。

4 展望

使用药物基因组学来优化抗凝治疗的有效性及安全性越来越引起人们的关注。将临床信息与药物遗传学结合到抗凝治疗过程中成为了目前研究的新方向。华法林相关基因检测可缩短达到稳定INR范围所需的时间，避免出血或脑卒中复发等不良事件的发生，为临床实践提供进一步合理化用药参考。尽管目前是否推行华法林基因检测以指导给药还存在争议，但随着抗栓治疗不断朝着个体化医学的方向发展，华法林基因检测必然会成为未来临床上的治疗趋势。相信不久的将来，真正量身定制式抗凝治疗方案会得以实现，在临床实践中更安全、有效地发挥其疗效。