韩双喜 王 丽 王介营 王玉虎 王海南 李传光 徐 萌 成良栋

山东省滨州市中心医院肝胆外科，山东省惠民县 251700

miRNA是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链RNA，长度20～23个核苷酸[1]。与正常组织来源细胞中的miRNA相比，大多数肿瘤组织中miRNA存在明显的表达差异，包括表达的上调和下调，因此，miRNA在肿瘤发生发展过程中起重要的调节作用[2]。有研究发现， miRNA-221在原发性肝癌中呈高表达[3]，但其对肝癌调控作用尚不明确。本研究通过下调miRNA-221的表达，研究其对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌细胞株HepG2受赠于滨州医学院；干扰序列、pHelper 1.0、pHelper2.0、引物和pGCSIL-GFP等由上海吉凯基因化学技术公司合成；限制性内切酶(NEB公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 构建慢病毒载体：首先依据能有效干扰人miRNA-221基因表达的靶序列制成双链DNA。然后其与pGCsil-GFP载体连接并转化。再通过PCR法筛选出阳性克隆，提取出质粒，然后再进行酶切并测序。再将pHelper1.0、pHelper2.0和重组慢病毒质粒共转染293T细胞，获得仅携带绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒NC-GFP-LV，以及携带下调miRNA-221基因表达的重组慢病毒miRNA-221-RNAi-LV。采用逐孔稀释法测定病毒的滴度。

1.2.2 测定病毒感染效率及HepG2细胞分组、转染：采用0～20不同感染梯度的病毒感染HepG2细胞，病毒在无血清培养基中感染HepG2细胞2h后，加入10%牛血清的培养基，培养3d后，流式细胞仪检测GFP的阳性表达率，确定感染效率。将HepG2细胞分为3组：(1)实验组(miRNA-221-siRNA，SI组)，即转染携带下调miRNA-221基因表达的重组慢病毒。(2)阴性对照组(negative control，NC组)，即进行转染但未携带慢病毒。(3)正常组(normal，N组)。

1.2.3 RT-PCR检测：转染72h后开始收集HepG2细胞， miRNA-221的目的基因PTEN的表达情况通过RT-PCR检测，通过PTEN的表达情况来判断干扰效果；同时检测促凋亡基因Caspase 3的表达情况。β-actin上游引物：5-CCCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3，下游引物5-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3，扩增条带为101bp；PTEN的上游引物为：5-CGGCAGCATCAAATGTTTCAG-3，PTEN的下游引物为：5-AACTGGCAG GTAGAAGGCAACTC-3，扩增条带为235bp；Caspase 3的上游引物：5-GTGGTACAGAACTGGACTGTGGC-3，下游引物：5-GTTGCCACCTTTCGGTTAACCCG-3，扩增条带为244bp。PTEN/β-actin和Caspase 3/β-actin吸光度比值分别表示PTEN mRNA和Caspase 3 mRNA的相对表达水平。

1.2.4 MTT比色法测定吸光度：将细胞每孔3×103个接种于96孔板中，每组接种10孔，置于37℃、5%CO2培养箱中进行细胞培养，细胞贴壁后进行慢病毒的转染，分别于24h、48h、72h、96h向每孔加入MTT 20μl(0.5mg/ml)，37℃孵育4h，然后丢弃MTT液，再加入150μl的DMSO，然后混合均匀，应用酶联免疫检测仪测定各孔490nm光吸收值，重复检测3次。比较各组HepG2细胞的生长情况。

1.2.5 transwell体外迁移实验：选用孔径为8μm的24孔Borden小室，上室加入1×105个细胞，总体积200μl，下室加入300μl含血清培养基，每组各设3个复孔。48h后取出小室，甲醇固定并Giemsa染色10min，去除上层小室侧的未迁移细胞，观察到达迁移杯底下面的细胞。显微镜下随机选取5个视野进行拍摄(×100倍)，计算每个视野的平均细胞数量。

1.2.6 Hochest33258荧光染色法检测细胞凋亡：首先将培养的细胞制成单细胞片, 然后应用4%多聚甲醛在室温下固定10min，再用PBS液洗涤2次,加入Hoechst33258均匀覆盖单细胞片，染色15min，再用PBS液清洗单细胞片3次,封片后在荧光显微镜下观察。正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞的细胞核则表现为浓染致密或断裂的颗粒块状荧光。随机于100倍荧光显微镜下照相。

1.2.7 荷瘤裸鼠动物模型的建立：将裸鼠随机分为实验组(SI组)、阴性对照组(NC组),每组5只，HepG2细胞悬液200μl于每只裸鼠背部皮下注射。采用瘤体内多点注射的方法，定时分组分别注射miRNA-221-RNAi-LV和空病毒NC-GFP-LV。每隔3d注射1次，每次病毒量为2×107个/只，共注射6次。之后每天观察肿瘤生长情况,每隔3d测量肿瘤的长、短径,计算肿瘤的体积。肿瘤体积=1/2×长径×短径2。绘制移植瘤生长曲线。于最后1次注射药物后3d颈椎脱臼法处死裸鼠,切取肿瘤组织标本。

2 结果

2.1 miRNA-221-RNAi-LV的构建及病毒滴度测定 miRNA-221基因干扰的重组细菌PCR扩增产物为270bp,鉴定结果与预期一致，测序结果表明,合成的miRNA-221的siRNA核苷酸序列插入正确,没有碱基缺失或替换。病毒滴度:miRNA-221-siRNA-LV和NC-GFP-LV均为2×109TU/ml。

2.2 病毒感染效率及干扰情况 采用(MOI=0～20)不同梯度的病毒感染HepG2细胞，并进行流式细胞仪分析。结果显示，MOI=0～20的不同感染梯度对HepG2细胞感染效率分别为0.38%(MOI=0)、22.37%(MOI=5)、73.06%(MOI=15)及95.10% (MOI=20)，MOI=20的感染滴度对HepG2细胞感染效率较高(95.10%)，见图1。转染72h后，PTEN的mRNA表达水平N组(0.034±0.001)、NC组(0.037±0.003)与SI组(0.123±0.005)相比较，SI组miRNA-221的靶基因PTEN表达增强，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图1 流式细胞检测GFP的表达率

2.3 MTT比色法测定miRNA-221-RNAi-LV对HepG2细胞增殖的影响 转染后24h，检测SI组的吸光度值开始下降，表明SI组的HepG2细胞增殖减弱，在之后的各个时间点，均表现为吸光度值降低。

图2 PTEN mRNA表达的灰度值

在96h NC组(1.070±0.020)和N组细胞(1.070±0.015)与SI组(1.030±0.023)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。这个结果表明下调miRNA-221的表达可以抑制HepG2细胞的增殖能力。

2.4 transwell体外迁移实验 经transwell小室培养模型培养后，对三组的穿膜细胞分别进行计数，NC组的迁移细胞数(43±4)、N组的迁移细胞数(45±4.1)和SI组的迁移细胞数(31±5.5)比较,差异有统计学意义(P<0.05)，而NC和N组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 miRNA-221-RNAi-LV对HepG2细胞增殖的影响

2.5 下调miRNA-221的表达对HepG2细胞凋亡的影响 荧光染色后,于荧光显微镜下观察细胞形态变化,凋亡的HepG2细胞发生核固缩,表现为浓染致密的颗粒块状荧光。SI组HepG2细胞增殖减弱，凋亡增加，荧光显微镜下观察可见较多的颗粒状荧光，这表明下调miRNA-221可以促进HepG2细胞的凋亡。

2.6 RT-PCR检测促凋亡基因Caspase 3变化 实验结果显示促凋亡基因Caspase 3的mRNA表达水平分别为N组(0.027±0.004)、NC组(0.029±0.003)和SI组(0.072±0.001)，三组相比较，SI组的Caspase 3表达增强，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 Caspase 3 mRNA表达的灰度值

2.7 miRNA-221-RNAi-LV对裸鼠移植瘤的抑制作用 通过肿瘤长短径计算移植瘤体积，移植瘤的生长曲线如图4所示，在注射HepG2细胞悬液3d后，SI组的移植瘤开始出现生长抑制表现，与NC组相比生长速度变慢，差异具有统计学意义(P=0.032 0，P<0.05)。

图4 裸鼠移植瘤的生长曲线

3 讨论

miRNAs通过与靶基因3’UTR结合，调控靶基因表达[4]，这是最近研究的热点问题。目前在人类已发现700 多种miRNAs，这些miRNAs可以影响正常细胞或肿瘤细胞的生长、增殖、分化、凋亡等一系列病理生理过程[5-6]。但大多数miRNAs 在肿瘤发生发展过程中的作用机制尚未完全阐明。在肿瘤中过表达的miRNAs被认为是癌基因，但是目前的研究也发现部分miRNAs在肿瘤中表达是下调的，如果其功能缺失或减弱就有导致正常的细胞发生恶变之可能，这类miRNAs被认为是抑癌基因。在某些肿瘤中，某些miRNAs的表达出现异常，多项研究发现，miRNA-221在肿瘤组织中异常表达，其中在甲状腺乳头状癌[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9-12]、肝细胞癌[13-14]、神经胶质瘤、胰腺癌、结直肠癌[15-16]等多种肿瘤中存在过表达，而在前列腺癌和胃肠道间质瘤[17]等多种肿瘤组织中存在低表达。此外， miRNA-221在乳头状甲状腺癌、结直肠癌、肝癌、肾细胞癌等肿瘤患者的血清或血浆中过表达。本实验结果显示，将miRNA-221-RNAi-LV转染HepG2细胞而导致PTEN基因表达上调，说明miRNA-221-RNAi-LV发挥下调miRNA-221作用显著。下调HepG2细胞的miRNA-221后，通过调节PTEN等信号通路而使HepG2细胞生长受到抑制、迁移能力减弱。miRNA-221的表达下调后肝癌HepG2细胞的凋亡增加，同时检测到Caspase 3的表达上调，这表明miRNA-221表达下调后促进Caspase 3的过表达是miRNA-221促进肝癌细胞凋亡的可能机制。这也提示miRNA-221在肝癌的发生发展过程中可能起癌基因的作用。

不同的研究对肝癌细胞的凋亡与miRNA-22l之间潜在关系有不同的研究结果。Dai等[18]的研究发现由内质网应激导致的细胞凋亡过程中，miRNA-22l模拟物促进肝癌细胞的凋亡，而miRNA-221阻遏物的作用恰恰相反。但Gramantieri等[19]则发现敲低miRNA-22l后，可以促进肝癌细胞SNU449的凋亡，同时该研究也发现与凋亡相关的Bmf也是miRNA-22l的分子靶标，这也表明通过影响蛋白的表达而抑制细胞的凋亡，这可能是miRNA-22l作用机制之一。

Pineau等的研究将MSCV-miRNA-221转染入小鼠肝祖细胞中，建立肝癌小鼠模型。其研究结果显示，与对照组相比，肿瘤发生发展的速度明显增快，这个研究结果也表明miRNA-221可促进肿瘤的发生、发展[20]。本文研究结果表明，miRNA-221表达下调后HepG2细胞的凋亡增加。有研究证实，miRNA-221可以活化AKT，其机制是miRNA-221与 PTEN基因的3’UTR区结合，进而调节PTEN的表达，使其表达下调，从而有效激活AKT[21]，其有效激活后可以促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭转移等。AKT与PTEN作为体内多个信号通路的关键因子， miRNA-221促进肝癌细胞增殖、侵袭转移的可能机制就是激活PTEN/AKT信号通路。

有研究发现miRNA-221的过表达可以影响肿瘤细胞对替莫唑胺、顺铂等化疗药物的敏感性，从而影响化疗效果。本研究中裸鼠移植瘤治疗组与对照组的生长情况存在统计学差异，但在临床实践中，因为体内复杂的肿瘤微环境，单一的基因治疗不一定能取得良好疗效，所以下调miRNA-221的表达并联合化疗药物或靶向药物治疗肝细胞肝癌，可能会取得更为有效的临床效果。

综上所述，miRNA-221-siRNA通过抑制miRNA-221的表达抑制肝癌HepG2细胞的增殖，促进其凋亡，降低其迁移能力。由于miRNA-22l在肝细胞癌中的过表达及与细胞增殖和凋亡密切关系，miRNA-221可以作为肝细胞癌基因治疗的新靶点，下调miRNA-221的表达并联合化疗药物或靶向药物治疗肝细胞癌，可能会取得更为有效的临床效果。