(贵州省林业科学研究院， 贵阳 550005)

西南红山茶(Camelliapitardii)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物，生于海拔1 000～2 400 m的林下、林缘或灌丛中。在贵州西部至中部、四川西南部至南部、云南南部至东南部、广西北部、湖南西部和湖北西部均有分布。贵州盘州市是西南红山茶的主要分布区，现有集中成片分布的野生林分约2 000 hm2。西南红山茶树型美观，花朵美丽，是一种优良的园林绿化树种[1,2]；西南红山茶籽油的脂肪酸组成与普通油茶籽油无差异，平均果油率9.2%，种仁含油率49.3%，不饱和脂肪酸含量87.29%，是贵州西部高海拔地区发展油茶产业的首选树种[3]。目前，西南红山茶的研究主要集中在脂肪酸组成、种质资源收集、表型性状变异及优良单株选择[4,5]等方面。ISSR(inter-simple sequence repeat)标记技术具有稳定性高、重复性好，操作简单等优点，已被广泛应用于遗传多样性分析、品种鉴定及亲缘关系分析、基因定位和分子标记辅助选择等方面[6-8]。桂腾琴等[9]对影响ISSR-PCR扩增的因子进行优化设计，建立了荷花品种的ISSR-PCR最佳扩增体系；曾惠敏等[10]利用ISSR分子标记，分析了八仙花的遗传多样；西南红山茶多处于野生状态，天然杂交形成了丰富的变异类型，本研究对>贵州西南红山茶自然分布的6个野生居群的37个单株进行ISSR分子遗传多样性分析，为野生西南红山茶的合理开发和有效利用提供科学依据和参考。

表1 采样地点及编号

图1 856号引物琼脂糖凝胶电泳图

1 材料与方法

1.1 材料来源

材料来源于西南红山茶自然分布的盘州市、威宁等地，每个居群随机选取2～12株长势健壮、无病虫害的植株，采集叶片放于-80 ℃冰箱中保存备用。供试材料编号及采集地详见表1。

1.2 实验方法

1.2.1总DNA的提取

西南红山茶的DNA采用北京索莱宝公司植物基因组DNA试剂盒提取，DNA提取、纯化后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及纯度。用1×TE溶液稀释至100 ng·μL-1后置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2ISSR-PCR 反应体系的建立

从合成的100条引物中筛选出6条多态性好的引物进行PCR扩增，并对反应条件进行优化，建立西南红山茶ISSR-PCR最佳扩增体系，西南红山茶ISSR-PCR扩增的引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2.3PCR扩增产物的检测及条带统计

PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测并拍照。

1.2.4条带统计及数据处理方法

ISSR为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带具有同源性[11]。根据电泳结果进行条带统计，同一位置强带和弱带均记为1，无记为 0，利用Popgene 32 软件分别计算平均观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s遗传多样性指数(H)和Shannon 多样性指数(I)等[12]。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR扩增体系的建立

利用4个不同种源的西南红山茶DNA对引物进行筛选，最终筛选出6条多态性高、稳定性好的引物分别对37个西南红山茶的DNA进行扩增，经优化后的西南红山茶ISSR-PCR 反应体系为：ISSR-PCR 反应总体积为20 μL，其中DNA 模板2 μL(约200 ng)，引物2 μL(10 μmol)，2×Mix(10 μL)，ddH2O 6 μL。反应程序为 94 ℃预变性5 min，然后94 ℃30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存，PCR产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果如图1所示。

2.2 西南红山茶ISSR扩增结果

从表1可以看出，用于西南红山茶ISSR扩增的引物多态性高，共扩增出条带89条，其中多态性条带82条，多态性比例为92.13%，8条引物扩增的条带数为12～18条，其中引物827扩增的条带最多；多态性条带为11～18条，平均为13.7条，其中引物827和引物845多态性最高，多态性比例达100%，扩增的条带片段大小集中在300～900 bp之间。

2.3 西南红山茶遗传多样性分析

利用 Popgene 32 软件对6个野生西南红山茶群体37个单株进行遗传多样性分析，结果表明，37个单株的平均观察等位基因数(Na)为1.921 3，平均有效等位基因数(Ne)为1.501 2，Nei’s遗传多样性指数(H)为0.296 2，Shannon信息指数(I)为0.447 7，说明西南红山茶单株间遗传多样性高，变异丰富。

2.4 西南红山茶亲缘关系分析

根据ISSR扩增结果对6个野生西南红山茶居群的遗传相似性进行分析，结果(表2)表明，6个居群的野生西南红山茶的遗传相似系数为0.705 9～0.936 7，遗传距离为0.065 4～0.384 2，其中威宁和清镇居群的西南红山茶遗传相似系数最低，为0.705 9；盘州市野生居群和毕节遗传相似系数最高，达0.936 7；遗传距离最小为0.065 4，由于居群1的分布点盘州市和居群2的分布点水城地理位置相近，气候特征相似，导致2个居群的野生西南红山茶相似性最大。

表2 不同引物的扩增结果

表3 遗传相似度和遗传距离

3 结论与讨论

目前，分子标记已广泛应用于山茶属植物的遗传多样性分析、品种鉴定、文库构建及重要基因的挖掘[13]，彭继庆等[14]构建了博白大果油茶的ISSR-PCR反应体系；宋倩倩等[15]利用ISSR分子标记对福建省浙江红花油茶遗传多样性进行了分析。本研究通过构建西南红山茶ISSR-PCR扩增体系，对贵州省6个居群37个西南红山茶单株进行遗传多样性分析，结果表明，37个野生西南红山茶多态性丰富、遗传多样性高；6条引物共扩增出89个条带，其中多态性条带82条，多态性位点百分率为92.13%；平均观察等位基因数(Na)为1.921 3，平均有效等位基因数(Ne)为1.501 2，Nei’s遗传多样性指数(H)为0.296 2，Shannon信息指数(I)为0.447 7，说明贵州野生西南红山茶变异丰富。李芳等研究表明，西南红山果花的性状变异丰富[2]；李彦福等对西南红山茶果实性状进行分析发现，西南红山茶单株在果高、果径、果皮厚度、籽粒数、脂肪酸成分及含量等性状间存在极显著差异[5]，为西南红山茶的选育提供了丰富的材料。ISSR-PCR扩增从分子水平揭示了西南红山茶的遗传多样性。从遗传相似系数和遗传距离可以看出，野生西南红山茶居群内遗传相似系数大，居群间相似度高，贵州省野生西南红山茶的遗传距离与实际的地理距离关系显著，说明西南红山茶的遗传变异受环境因素影响较大。由于分布区内海拔高差大，气候多样，形成了丰富的自然变异，为西南红山茶的选育奠定了丰富的物种基础；西南红山茶是高海拔地区重要的木本油料树种，本研究分析了贵州省西南红山茶的遗传多样性及亲缘关系，为西南红山茶种质资源的开发及品种配置提供了理论依据。