(河南科技学院生命科技学院/现代生物育种协同创新中心， 河南 新乡 453003)

我国土壤重金属污染现象十分严重，是目前危害农业生产和人类健康的主要环境问题之一。近年来，随着工业化发展、城市化规模扩张以及农业化生产对土壤的影响，全国范围内的汞污染土壤问题十分严峻，已经对水环境和农产品质量构成严重威胁[1,2]。土壤中的汞会通过生物富集进入农产品，再经食物链进入人体，威胁人类健康，同时引发环境问题[3,4]。因此，作物抗逆性育种研究的一个重要方向就是选择低累积、耐重金属的作物新材料种植于受污染的土地。

重金属汞对高等植物的生长发育有严重影响。邹继颖等[5]、蒋家焕等[6]对水稻进行研究表明，随着营养液中汞施入量的逐渐增加，水稻根、茎、叶对汞的吸收也增加，生育期较短的水稻材料吸收效率最明显。在大豆中的研究表明，随着土壤外源汞浓度的增加，大豆的出苗率、根系生长速率受到不同程度的抑制，导致幼苗生长速率减缓[7]。陈礼洪等研究发现，汞污染在低浓度时可促进油菜生长，汞浓度超过1.0 mg·kg-1时，就显著抑制油菜生长，引起叶片变小、失绿变黄甚至枯萎等现象[8]。汞污染也严重危害水生植物的生长发育，低浓度的汞污染可导致抗氧化酶系统活性的增强，而高浓度的汞污染会对水生植物造成不可逆转的影响[9]。计汪栋等研究了菹草对Hg2+胁迫的应答反应，重金属毒害植物的一个重要特征就是引起叶绿素减少、蛋白质含量降低，从而使植物失绿，产生毒害现象[10]。随着研究的深入，发现汞对植物的污染可损伤细胞超微结构，最终破坏细胞膜系统的稳定[11]。

棉花是我国重要的经济作物，同时也是对重金属等非生物逆境胁迫耐性较强的作物之一[12]。虽然重金属胁迫对棉花的生长发育造成不利影响，但因棉花自身具有较完整的应对重金属胁迫的适应保护机制，且棉花主产品非食用的特点，可作为重金属污染土壤中的一种修复作物[13]。本研究选择6个不同棉花材料进行汞污染处理，测定HgCl2胁迫对棉花发芽率、发芽势，并对幼苗叶绿素含量、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、过氧化物酶的活性和根系活力进行分析，以期为抗汞棉花品种的选育和污染土壤上棉花种植提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以6个不同类型的棉花品种作为供试材料：中S 9612(敏旱、敏盐)、中H 117(耐旱)、中9835(耐盐)、中棉所50、百棉15和早铃1号。

1.2 设计与处理

挑选大小均匀、籽粒饱满的棉花种子，用2%的次氯酸钠溶液消毒10 min，然后用蒸馏水反复冲洗干净，再用灭菌的蒸馏水浸种24 h，以铺有2层滤纸的培养皿作为发芽床进行种子发芽试验。采用0.5 mmol·L-1的HgCl2溶液对棉花种子进行萌发期胁迫处理，蒸馏水作对照，将种子排列在铺有2层浸湿不同浓度处理液滤纸的培养皿中，以种子和滤纸湿润为宜。每个处理100粒种子，3次重复，放入温度28 ℃、光/暗周期为14 h/10 h的人工气候箱中培养。每天观察记录发芽种子数。另取试验材料播种于处理和对照的营养土中，待棉花长出3 片真叶时开始起苗取样，每次每个处理取样3～5片叶，用蒸馏水冲洗干净后，吸水纸吸干，剪碎，称取棉花叶片，每份0.3 g 左右，编号包装，用液氮速冻后，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 测定指标与方法

取处理样品测定各生理指标，用丙酮浸提法测定叶片的叶绿素含量，用茚三酮比色法测定脯氨酸含量，考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量，比色法测定超氧化物歧化酶(SOD) 活性，愈创木酚氧化法测定过氧化物酶(POD)活性，将根尖样品采用TTC法测定其根系活力。

1.4 数据统计与分析

利用Excel 2017软件进行数据整理，采用SAS软件分析6个材料在HgCl2处理和对照中的差异显著性，并用GraphPad Prism 5软件作图。

2 结果与分析

2.1 汞胁迫对不同材料棉花种子萌发的影响

试验结果表明，6个棉花材料的种子以中50发芽势最高，其次是中H 117和中S 9612，经过HgCl2胁迫处理后，中S 9612的发芽势下降幅度最小，其余5个材料的发芽势都低于20%,可以看出，6个棉花材料的种子中的中S 9612发芽势所受影响最小，中50所受处理影响最大；6个棉花种子发芽率都高于80%，而在胁迫后中S 9612的发芽率下降幅度最小，其次是中H 117和中9835，而百棉15发芽率下降幅度最大，发芽率降至20%，说明该材料棉花种子在汞处理后大部分种子没有发芽，很可能是胁迫处理导致种子死亡而引起的。

2.2 汞胁迫对棉花幼苗生长的影响

胁迫下叶绿素含量的变化，在一定程度上可以反映植物抵抗外界胁迫的能力。理论上，一定的胁迫可使植物做出抵触反应，体内叶绿素a和叶绿素b含量会短时间内升高，而过多的胁迫则使植物体内叶绿素含量降低。6个棉花材料在对照组中，中9835的叶绿素a含量最高，其次是早铃1号和中H 117。处理后，中S 9612、中H 117和早铃1号的叶绿素a和叶绿素b的含量与对照相比均升高，中50和百棉15叶绿素a含量比对照含量低。

在植物遇到外界胁迫时，植物体内会积累大量的游离脯氨酸。在植物体内大量的、高浓度的游离脯氨酸可以帮助植物抵抗外界胁迫，通过试验测定游离脯氨酸含量的变化来判断胁迫对棉花幼苗的影响。由图3可知，处理前百棉15体内游离脯氨酸的含量最高，其次是中S 9612和中50。处理后，中S 9612、中9835、中50和早铃1号的游离脯氨酸含量比对照都低，而中H 117和早铃1号比对照高。分析结果可得，中H 117和早铃1号对0.5 mmol·L-1的HgCl2有抵触胁迫作用，而另外4种材料则因胁迫处理浓度过大使脯氨酸含量下降。

图3 HgCl2胁迫下6种棉花材料的游离脯氨酸含量

2.3 汞胁迫对棉花可溶性蛋白和POD活性的影响

植物在逆境条件下可通过提高可溶性蛋白的合成速率，增加其含量来直接参与适应逆境胁迫，高含量的可溶性蛋白可使细胞维持较低的渗透势，抵抗胁迫带来的伤害。由图4可知，在所有处理组中可溶性蛋白含量最高的是中50，其次是百棉15和中S 9612。处理后，中S 9612、中H 117、中9835和早铃1号的可溶性蛋白含量都比对照高，中50和百棉15比对照低。

SOD能催化生物体内超氧自由基歧化反应的产生，可有效清除氧自由基，并防止氧自由基破环细胞结构功能。对照组中，中9835的超氧化物歧化酶活性最高，由图5可知，在所有处理中，中9835的超氧化物歧化酶活性也是最高，中S 9612、中50和早铃1号均比对照活性低，其他2个材料无明显变化。

POD是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，它们能催化很多反应。POD是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，普遍意义上来讲，POD可以催化消除植物体内不利因子的反应。棉花组织内含有大量的POD，它与植物生长发育过程中生理生化变化有着紧密的联系。对照组中，中S 9612的POD活性最高，其次是中H 117和百棉15。由图6可知，中H 117的活性比对照低，其他材料中的POD活性均比对照高，其中早铃1号的POD活性增加幅度最大，其次是中50和中9835。

图4 HgCl2胁迫下6种棉花材料的可溶性蛋白含量

图5 HgCl2胁迫下6种棉花材料的SOD活性

图6 HgCl2胁迫下6种棉花材料的POD活性

2.4 汞胁迫对棉花根系活力的影响

根系是植物维持生存的基础，它可以吸收水分、养分、矿物营养和合成有机物。由图7可知，中9835的根系活力TTC还原强度最强，其次是中H 117和中50。处理过后，所有材料的根系活力TTC还原强度与对照相比都在下降，下降最小的棉花材料是中9835，而中9835的TTC还原强度远高于其它5个材料。

图7 HgCl2胁迫下6种棉花材料的根系活力

3 结论与讨论

植物在受到胁迫后会启动相应的防御机制，以降低环境变化对自身的损害[14,15]。本研究对6个棉花材料进行0.5 mmol·L-1的HgCl2处理，从发芽率、生理特性、保护酶系统和根系活力等方面探讨了棉花在重金属汞胁迫下的耐受力。

本试验选取的高浓度HgCl2溶液对6种材料的发芽势和发芽率均有所影响，表现为发芽势和发芽率大幅度下降，其中中S 9612的发芽率下降幅度最小，其次是中H 117和中9835。研究表明，高浓度的铜、铅、铬等重金属处理植物种子时对其发芽率有明显抑制作用[16-18]。而高浓度Hg2+溶液处理小麦和蔬菜作物后，叶绿素含量会明显下降，严重者叶片畸形、脱落，茎基部腐烂，植株濒于死亡[19,20]。本试验在较高浓度的汞处理后，中50和百棉15两个棉花材料的幼苗体内的叶绿素含量降低，随着毒害时间延长，叶片发生干枯甚至脱落，其余4个材料的叶绿素含量升高，可见对这4个材料而言，该处理浓度尚不能对植物造成胁迫危害。植物受到外界胁迫时体内也会积累大量的游离脯氨酸，而且会提高植物体内可溶性蛋白的合成速率，可溶性蛋白可直接参与并应对逆境胁迫[21,22]。本试验中，中H 117和早铃1号的游离脯氨酸含量与对照相比较明显增多，中H 117、中9835、中S 9612和早铃1号的可溶性蛋白的含量与对照相比较明显升高，从这几个生理指标的研究可发现，中H 117和早铃1号的表现较好。

重金属诱导产生的活性氧化胁迫可通过高效的酶促系统进行清除，植物体内活性氧自由基的产生与保护酶系统 SOD、POD 及过氧化氢酶(CAT)等有效清除氧自由基，防止氧自由基破环细胞结构功能，维持氧化还原的动态平衡，从而缓解氧化伤害增加抗逆性[23-25]。6个棉花材料中，中H 117和中9835的SOD酶和POD酶含量均增加，说明该浓度汞胁迫使植物叶片细胞膜受到破坏，致使胞内物质流失严重，耐盐、耐旱材料在重金属胁迫下的耐受力强于其它材料。土壤重金属向植物根部迁移是植物吸收累积重金属的重要一步[26]，根系活力的高低直接反映出植物的生长发育状况以及作物产量，汞胁迫后植物的根系也能表现出该植物对重金属汞的逆境胁迫处理的机体反应。不同材料之间因品种不同而表现出根系活力不同程度的下降，中9835的根系活力受影响最小，说明该材料植物根系依然能从土壤中获取足够的养分来抵抗胁迫。

综上所述，从发芽势、发芽率来衡量6个材料的抗逆性，中S 9612的表现最好；从棉花幼苗生理生化指标的测定和保护酶系统以及根系活力来判断，可以得出6个棉花材料中的中H 117和中9835表现优良，可以抵抗一定的重金属汞污染，适宜在重金属污染的土地上种植幼苗。