王琼， 金舒文， 周利， 邹燃， 乐薇， 杨敏， 孙滨， 庞争争， 方霁

电针丰隆穴对高脂血症的疗效及对巨噬细胞ABCA1/JAK2/STAT3信号通路的影响*

王琼1△， 金舒文2， 周利1， 邹燃1， 乐薇1， 杨敏1， 孙滨1， 庞争争1， 方霁3

（1武汉市中西医结合医院针灸科，湖北 武汉 430022；2湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北 武汉 430061；3中国科学院广州生物医药与健康研究院，广东 广州 510530）

探究电针丰隆穴（ST40）对高脂血症患者的降脂疗效及对巨噬细胞ATP结合盒转运体A1 （ABCA1）/Janus激酶2 （JAK2）/信号转导和转录激活因子3 （STAT3）信号通路的影响。将105例临床辨证为痰浊阻遏证的高脂血症患者随机分为电针组、药物组与对照组，其中电针组予以电针针刺丰隆穴治疗（=35）；药物组予以口服血脂康治疗（=35）；对照组不予以特殊处理（=35）。观察治疗前及治疗后3个月和6个月3组患者血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平变化；取各组患者血清与人THP-1细胞源性巨噬细胞共培养，采用RT-qPCR及Western blot检测各组巨噬细胞ABCA1、JAK2和STAT3的mRNA和蛋白表达。治疗结束后，电针组总有效率为85.7%，药物组总有效率为88.6%，两者改善血脂的总有效率无显著差异（>0.05）；电针组与药物组的TC、TG和LDL-C下降水平差异无统计学意义（>0.05）。治疗后3个月和6个月，药物组TC、TG和LDL-C水平较治疗后升高（<0.05），而电针组仍较稳定（>0.05）。治疗后电针组与药物组巨噬细胞ABCA1、JAK2和STAT3的mRNA及蛋白表达较对照组均显著升高（<0.05）；电针组与药物组比较，两者变化无显著差异（>0.05）。电针丰隆穴可降低高脂血症患者TC、TG和LDL-C水平，且疗效较药物治疗稳定，可上调巨噬细胞ABCA1、JAK2和STAT3的mRNA和蛋白表达，促进胆固醇逆转运，抑制炎症反应。

高脂血症；电针；丰隆穴；ABCA1/JAK2/STAT3信号通路；巨噬细胞

高脂血症是动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）的独立危险因素，严重威胁人类的健康，全球每年约有2 000万患者死于动脉粥样硬化性疾病［1-2］。高血脂导致血管内皮损伤，产生一系列炎症和免疫反应，诱导巨噬细胞形成泡沫细胞，造成内皮下脂质堆积，最终形成动脉粥样硬化［3］。目前治疗高脂血症和预防动脉粥样硬化的主要方法为口服降脂药物，但存在肝肾功能损害及胃肠道反应等不良反应。针刺作为一种补充替代疗法，前期研究已显示针刺丰隆穴具有降脂作用［4-5］，且动物实验证实，针刺可提高高脂血症大鼠ATP结合盒转运体A1 （ATP binding cassette transporter A1， ABCA1）的表达从而促进胆固醇逆转运，并减轻巨噬细胞炎症反应［6-8］。但针刺丰隆穴对高脂血症患者血清巨噬细胞ABCA1及其下游的Janus激酶2 （Janus kinase 2， JAK2）/信号转导和转录激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）信号通路的调节作用尚不明确。

高血脂诱导巨噬细胞形成泡沫细胞。是介导细胞内胆固醇流出的关键基因，其通过多种途径将胞内胆固醇和磷脂转运至胞外，减少胞内脂质负荷，并抑制炎症因子释放，从而预防AS［9-10］。研究表明，巨噬细胞中的ABCA1与磷脂蛋白结合后激活多种下游信号通路，包括JAK2/STAT3信号通路，产生一系列瀑布反应，从而进一步促进脂质逆转运及炎症因子的降解［11］。本实验通过观察高脂血症患者治疗前及治疗后3个月和6个月的血脂水平，并取不同治疗方式后患者血清与巨噬细胞体外共培养，检测巨噬细胞中ABCA1、JAK2和STAT3 mRNA及蛋白表达，探究电针（electro-acupuncture， EA）丰隆穴对高脂血症患者的临床疗效及对巨噬细胞信号通路的调节，为针刺丰隆穴治疗高脂血症预防动脉粥样硬化提供参考资料。

材料和方法

1　临床资料

1.1一般资料共筛选132例2017年10月~2019年2月于武汉市中西医结合医院针灸科就诊的高脂血症患者，从中选取符合标准的痰浊阻遏证高脂血症患者105例，按随机数字表分为电针（EA）组、药物（Xuezhikang）组和对照（control）组，每组35例，见图1。3组患者的性别、年龄和病程等一般情况比较差异无统计学意义（>0.05），具有可比性，见表1。本研究经武汉市中西医结合医院临床研究伦理委员会批准，所有受试患者均签署知情同意书。

Figure 1.　Flow chart of case recruitment.

表1　3组高脂血症患者一般资料比较

1.2诊断标准

1.2.1西医诊断标准参照中国成人血脂异常防治指南修订联合委员会修订的《中国成人血脂异常防治指南（2016年修订版）》［12］。正常饮食状态下，禁食12~14 h后，监测血脂水平，达到以下3项中1项或1项以上者可诊断为高脂血症：（1）总胆固醇（total cholesterol， TC）≥5.20 mmol/L；（2）低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol， LDL-C）≥3.4 mmol/L；（3）甘油三酯（triglyceride， TG）≥1.70 mmol/L。

1.2.2中医诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》中关于“高脂血症”诊断标准［13］。选取痰浊阻遏证，其诊断依据为：（1）主症：体胖，胸闷脘痞，喜呕吐痰涎，头重如裹，肢体沉重麻木；（2）兼症：失眠，口淡，纳差，食少等；（3）舌脉：舌淡胖，苔白腻，脉弦滑。以上主症具备两项，结合兼症、舌脉即可诊断。

1.3纳入标准（1）符合中医痰浊阻遏证型和西医诊断标准；（2）年龄在30~70岁之间，诊断为原发性高脂血症患者；（3）或曾服用调脂药物治疗，但已停药2周或2周以上，血脂水平仍符合诊断标准者；（4）对实验知情并签署知情同意书者。

1.4排除标准（1）对降血脂药物过敏者，妊娠期或哺乳期妇女；（2）半年内曾患心脑血管意外，如急性心肌梗死、脑梗死、严重创伤或重大手术后患者；（3）年龄在30~70岁之外，诊断为继发性高脂血症患者；（4）纯合子型高胆固醇血症患者，以及服用如吩噻嗪类和肾上腺皮质类固醇类等药物继发的高脂血症患者；（5）正在使用影响血脂代谢药物的患者，如服用肝素和甲状腺素等；（6）近2周内曾接受其他可降低血脂药物治疗的患者；（7）合并有心血管系统、呼吸系统、消化系统和泌尿系统等其他系统严重原发性疾病；（8）患有精神疾病的患者。

1.5剔除标准（1）进入试验后，不符合纳入标准或符合排除标准者；（2）在试验过程中，存在明显的干预因素影响试验疗效或安全性者；（3）试验期间出现病情恶化或死亡的患者；（4）试验过程中拒绝继续试验的患者；（5）出现严重不良事件或不良反应的受试者。

2　治疗方法

2.1电针组患者取仰卧位，充分暴露双下肢，选取双侧丰隆穴，局部常规消毒，将0.32 mm×50 mm “健卫仕牌”无菌针灸针（中美合作泰成科技发展有限公司，型号S3210）以90°角垂直皮肤快速进针，进针深度约40 mm。并取双侧丰隆穴近心端约0.5 cm处垂直刺一辅助针，深度约15 mm。双侧均接LH202H型韩氏穴位神经刺激仪（北京华卫产业开发公司），丰隆穴处接负极，辅助针处接正极。电针仪刺激参数：直流电，等幅疏密波，频率2/100 Hz，强度8~12 mA，以患者耐受为度。每次留针30 min，每日治疗1次，每周连续治疗6 d，共治疗8周。

2.2药物组嘱患者口服血脂康胶囊（北京北大维信生物科技有限公司，批号20171158），每日2次，每次2粒，共连服8周。

2.3对照组不予以特殊处理。

2.4生活处方电针组、药物组和对照组3组患者均嘱其低脂饮食，改善生活方式（适当增加运动），控制其他心血管病危险因素，如限酒、戒烟和限盐等，并嘱患者在治疗期间禁用其他影响试验结果的药物及治疗措施。

3　疗效观察

3.1检测指标

3.1.1血脂检测分别于开始治疗前1 d、治疗结束后1 d、治疗后3个月和治疗后6个月，清晨空腹12 h（可少量饮水），抽取前臂静脉血。取血前1 d内不饮酒、不做剧烈运动；若服用影响血脂水平的药物，应记录用药情况。采用中华医学会检验学会推荐的方法检测TC、TG、LDL-C和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）：TC及TG均采用酶比色法（GPO-PAP法）［14-15］，HDL-C采用磷钨酸镁（PTA-Mg2）沉淀法［16］，LDL-C采用聚乙烯硫酸盐（PVS）沉淀法［17］。

3.1.2血清巨噬细胞内ABCA1、JAK2和STAT3指标检测人血清与巨噬细胞共培养方法。治疗结束后抽取各组患者静脉血留置于肝素钠试管混匀。采用600×离心10 min，取5 mL上层血清于EP管中，于-80℃保存备用。将解融后的细胞悬液离心，后置于完全培养液重悬，于CO2培养箱中培养。待细胞汇合度达到90%时，吸除原有培养液，用PBS洗1遍后加适当的胰蛋白酶，消化1~5 min，吹打细胞使细胞悬浮。选择对数生长阶段的细胞完成巨噬细胞培养。将巨噬细胞铺装于含有1 mL RPMI-1640培养液（无FBS）的12孔板，随机分为电针组、药物组和对照组，分别加入不同患者血清250 μL共培养24 h。

采用RT-qPCR法检测各组患者血清对巨噬细胞ABCA1、JAK2和STAT3 mRNA含量。使用Trizol RNA试剂盒提取巨噬细胞总RNA。采用分光光度法测定RNA浓度后，按照逆转录试剂盒说明书，用Prime ScriptTMRT Master Mix逆转录RNA。以GAPDH为内参照， RT-qPCR定量分析各组细胞中ABCA1、JAK2和STAT3的mRNA含量。每个待测样本均有3管平行管。采用2-ΔΔCt法计算相对mRNA 水平表达量。引物序列见表2。

表2　RT-qPCR引物序列

Western blot实验：提取各组巨噬细胞蛋白并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度。行SDS-PAGE后，用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶（0.5%TBST配制），封闭1 h。加入Ⅰ抗（ABCA1，1∶40 000稀释， JAK2和STAT3，1∶1 000稀释），4℃孵育过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶3 000稀释），室温下孵育30 min后，洗膜。ECL发光，显影，定影。PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的吸光度值。

3.2疗效评价标准参照临床药物研究指导原则［18］：（1）显效：治疗后血脂检测满足以下任一项者， TC下降≥20%， TG下降≥40%， HDL-C上升≥0.26 mmol/L， TC-HDL-C/HDL-C下降≥20％；（2）有效：治疗后血脂检测满足以下任一项者， TC下降10%~20%， TG下降20%～40%， HDL-C上升0.104~0.26 mmol/L， TC-HDL-C/HDL-C下降10%~20%；（3）无效：未达有效标准；（4）恶化：治疗后血脂检测满足以下任一项者， TC上升≥10%， TG上升≥10%， HDL-C下降≥0.104 mmol/L， TC-HDL-C/HDL-C增高≥10％。总有效率（%）=（显效+有效）/总例数×100%。

4　统计学处理

所有数据均采用SPSS 26.0进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，3组间血脂比较采用双因素方差分析，并用Mix-Effect进行两两比较；3组间BCA1、JAK2和STAT3 mRNA及蛋白比较采用单因素方差分析，并用最小显著性差异法（LSD法）进行两两比较；组内比较采用配对检验。计数资料采用卡方检验分析。以<0.05为差异有统计学意义。

结果

1　各组临床疗效

由表3可见，对照组总有效率为0，药物组总有效率为88.6％，电针组总有效率为85.7％，两组分别与对照组比较有显著差异（<0.05），两组间经χ检验比较无显著差异（>0.05）。

表3　各组患者临床疗效比较

*0.05control group.

2　各组患者血脂水平变化

2.1治疗后各组患者血脂水平的比较治疗前各组患者血清TC、TG、LDL-C和HDL-C差异无统计学意义（>0.05），具有可比性。治疗后电针组与药物组的TC、TG和LDL-C水平较同组治疗前均显著下降（<0.05），且较对照组有显著差异（<0.05）。与药物组相比，针刺组上述指标下降水平无显著差异（>0.05）。对照组治疗前后各指标无显著差异（>0.05）。见表4。

表4　各组患者治疗前后血脂结果比较

P<0.05before the treatment in the same group;#0.05control group.

2.2随访期各组患者血脂水平比较由表5可见，检测随访期3组患者的血脂水平，电针组治疗后3个月和治疗后6个月TC、TG和LDL-C水平与治疗后相比无明显差异（>0.05）；药物组治疗后3个月和治疗后6个月TC、TG和LDL-C水平与治疗后比较有显著差异（<0.05）。药物组治疗后3个月和治疗后6个月TC、TG和LDL-C水平与对照组比较仍有显著差异（<0.05）。药物组和电针组治疗前后及随访HDL-C变化差异无统计学意义（>0.05）。对照组治疗前后各项指标差异均无统计学意义（>0.05）。

表5　各组患者随访血脂结果测定比较

P<0.05after the treatment in the same group;#0.05control group.

3　各组巨噬细胞中ABCA1、JAK2和STAT3 mRNA表达水平的比较

治疗后药物组和电针组ABCA1、JAK2和STAT3的mRNA表达均显著高于对照组（<0.05）；和药物组相比，电针组ABCA1、JAK2和STAT3的mRNA表达无显著差异（>0.05），见图2。

Figure 2.　The mRNA expression of ABCA1, JAK2 and STAT3 in each group was detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=35. *P<0.05 vs control group.

4　各组巨噬细胞中ABCA1、JAK2和STAT3蛋白表达水平的比较

治疗后药物组和电针组ABCA1、JAK2和STAT3蛋白表达显著高于对照组（<0.05）；与药物组相比，电针组蛋白表达无显著差异（>0.05），见图3。

Figure 3.　The protein expression of ABCA1, JAK2 and STAT3 in each group by Western blot. Mean±SD. n=35. *P<0.05 vs control group.

讨论

在高血脂水平下，单核细胞经氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）及各类趋化因子和生长因子介导分化为巨噬细胞，吞噬脂质沉积于内皮下，发生一系列炎症和免疫反应，最终形成动脉粥样硬化。而巨噬细胞膜转运蛋白ABCA1可通过介导胞内胆固醇和磷脂对HDL和载脂蛋白A1（apolipo-proteinA1，Apo A1）的活性转运，清除胞内脂质，同时ApoA1阻碍ABCA1蛋白的降解以稳定ABCA1蛋白质含量［19］。ABCA1可作为抗炎受体发挥一定的抗炎作用，且其抗炎活性仅次于其脂质调节能力［20-21］，其下游JAK2/STAT3信号通路同时参与脂质调节与抗炎作用。JAK2受ABCA1激活后，发挥前馈机制作用，进一步增强ABCA1与Apo A1的活性结合，提高胆固醇逆转运效率。同时有研究证实，与基因的启动子有良好位点结合，直接调控的基因表达［22-23］。在抗炎作用方面，JAK2激活下游STAT3，从而抑制炎症因子（如肿瘤坏死因子α和白细胞介素6）的产生。因此，JAK2/STAT3通路可能通过提高脂质逆转运效率、抑制炎症的产生，从而达到防治动脉粥样硬化的作用。

既往临床试验证实针刺丰隆穴相比于药物降脂疗效更稳定，且无肝酶升高和胃肠道反应等副作用，可作为一种安全有效的调节血脂方法［24-25］。解秸萍等［4］观察到电针丰隆穴相较于口服血脂康，在治疗高脂血症时具有良好的后效应，随访1个月时电针组TG仍持续显著下降。我们前期研究显示电针丰隆穴能调节高脂血症大鼠血脂水平，显著上调大鼠巨噬细胞的mRNA和蛋白表达，降低细胞内胆固醇负荷，并能减少巨噬细胞内炎症因子的含量、增加抗炎因子的含量，达到预防动脉粥样硬化的目的［7-8，26］。在中医学范围内，高脂血症属“痰浊”、“痰瘀”范畴，与脾虚痰浊关系最为密切，病机总属本虚标实［27-28］。丰隆穴为足阳明胃经络穴，一穴通二经，具有运脾和胃，化痰利湿之功，为治痰之要穴。文献研究显示临床多以电针丰隆穴为主治疗高脂血症［29-30］，上述研究表明电针丰隆穴具有调节血脂，抑制动脉粥样硬化的作用。但电针丰隆穴的长期疗效，及其对高脂血症患者血清对体外巨噬细胞中ABCA1及其下游信号通路的调节作用尚不明确。本研究从患者治疗前、后及随访期血脂水平，、和mRNA和蛋白的表达水平探究针刺治疗高脂血症的有效性及对ABCA1/JAK2/STAT3通路的影响。

本研究结果显示，电针丰隆穴治疗后能显著降低患者血脂水平，对TC、TG和LDL-C有明显的下调作用，效果与口服血脂康相当。治疗后3个月和治疗后6个月，血脂康组患者TC、TG和LDL-C水平上升，而电针组患者血脂水平仍较稳定，说明长期疗效方面电针治疗优于口服血脂康治疗。电针丰隆穴和口服血脂康治疗后，患者血清对巨噬细胞中、和mRNA及蛋白的表达水平显著上升。上述结果表明电针丰隆穴具有稳定的降脂疗效，且其降脂和抗炎机制可能是通过调控ABCA1/JAK2/STAT3信号通路，提高胆固醇逆转运效率并抑制炎症因子的释放而实现的，进而达到预防动脉粥样硬化的目的。我们初步探讨了电针丰隆穴对高脂血症患者调节血脂的长期疗效，并从转录水平调控了巨噬细胞ABCA1/JAK2/STAT3信号通路的表达。但本实验受试者样本数量较少，结果可能存在一定偏移，且仅对ABCA1、JAK2、STAT3信号通路进行了初步研究。今后需开展更多的大样本临床研究，且其上游信号以及下游炎症因子的作用值得进一步探讨。

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Effects of electro-acupuncture at Fenglong point（ST40）on treatment of hyperlipidemia and ABCA1/JAK2/STAT3 signaling pathway in macrophages

WANG Qiong1， JIN Shu-wen2， ZHOU Li1， ZOU Ran1， LE Wei1， YANG Min1， SUN Bin1， PANG Zheng-zheng1， FANG Ji3

（1，，430022，；2，，430061，；3，，510530，）

To observe the clinical effect of electro-acupuncture at Fenglong point（ST40） on the treatment of hyperlipidemia， and the ATP-binding cassette transporter A1 （ABCA1）/Janus kinase 2 （JAK2）/signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3） signaling pathway in macrophages.The patients suffer from hyperlipidemia （=105） were randomly divided into electro-acupuncture group， Xuezhikang group and control group. The patients in electro-acupuncture group were treated with electro-acupuncture at ST40 （=35）， the patients in Xuezhikang group took orally Xuezhikang capsules （=35）， and the patients in control group were not given any special treatment （=35）. The levels of total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C） and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C） were detected before and at the 3rd and 6th months after treatment. The serum of each group was co-cultured with human THP-1 cell-derived macrophages. RT-qPCR and Western blot were performed to detect the signaling molecules ABCA1， JAK2 and STAT3 in the macrophages at mRNA and protein levels.After treatment， the total effective rate of electro-acupuncture group was 85.7%， and that of Xuezhikang group was 88.6%. No significant difference in the total effective rate of improving blood lipid between the 2 groups was observed （>0.05）.There was also no significant difference of the decrease in TC， TG and LDL-C between electro-acupuncture group and Xuezhikang group（>0.05）. Compared to the end of the treatment， the levels of TC， TG and LDL-C in Xuezhikang group were increased significantly at 3rd and 6th months after the treatment （<0.05）， while no significant change in electro-acupuncture group was found before and after treatment （>0.05）. The mRNA and protein levels of ABCA1， JAK2 and STAT3 in the macrophages in electro-acupuncture group and Xuezhikang group were significantly higher than those in control group （<0.05）， and no significant difference between electro-acupuncture group and Xuezhikang group was detected （>0.05）.Electro-acupuncture at ST40 reduces the levels of TC， TG and LDL-C， and the curative effect is more stable than Xuezhikang. This treatment also increases the expression of ABCA1， JAK2 and STAT3 at mRNA and protein levels in the macrophages， which promotes the reversal of cholesterol transport， and inhibits the inflammatory response.

Hyperlipidemia； Electro-acupuncture； Fenglong point； ABCA1/JAK2/STAT3 signaling pathway； Macrophages

R246.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.008

1000-4718（2020）11-1972-08

2020-05-11

2020-09-18

国家自然科学基金资助项目（No.81803802）;武汉市卫生和计划生育委员会青年项目（No.WZ17Q01）

Tel： 13628602261; E-mail： joan910@sina.com

（责任编辑：林白霜，宋延君）