李巧稚，王娅菲

子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，全球每年约50万新发病例，其中80%患者来自发展中国家[1]。高危型人乳头状瘤病毒(human papillomavirus, HPV)持续感染导致子宫颈上皮基因表达异常，促使细胞转化为癌性表型。有研究发现HPV相关口咽鳞癌中病毒DNA与癌细胞基因整合，在肿瘤细胞周围形成特殊微环境，使肿瘤细胞发生免疫逃逸，而周围病毒基因缺失的黏膜上皮间质中细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)及细胞因子未见异常，由此认为病毒整合的肿瘤细胞是免疫抑制的主要目标[2]。共刺激分子是T(或B)细胞完全活化提供共刺激信号的细胞表面分子及其配体，是微生物的产物或固有免疫针对微生物的应答成分。其中较为重要的共刺激分子是B7-1和B7-2、B7-H1和B7-H2。B7-H1又称为程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1, PD-L1)，是上皮细胞异常表达的免疫调节分子，CTL的PD-1受体与肿瘤细胞表面B7-H1结合，促使T淋巴细胞发生凋亡，使肿瘤细胞逃避CTL的攻击[3]。研究表明B7-H1除广泛低表达于抗原呈递细胞、非造血细胞和免疫豁免部位如胎盘、睾丸等正常组织细胞中[4]，在各种实体肿瘤中高表达[5-6]。研究已证实高危型HPV感染与子宫颈鳞癌的发生、发展密切相关[7-8]。本文拟通过检测HPV16 E6 mRNA在不同子宫颈细胞系中的含量和高危型HPV16在子宫颈病变患者的感染率、B7-H1蛋白在细胞系和子宫颈病变组织中的表达，分析B7-H1在子宫颈病变演进过程中的作用及与高危型HPV16感染的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞系及临床病理资料转染HPV16 E6基因的正常子宫颈上皮细胞(H8细胞)系、人类永生化表皮细胞(HaCat)系、子宫颈癌细胞[SiHa(HPV16感染)、Caski(HPV16、18共同感染)和HeLa细胞(HPV18感染)]系均由李官成教授(中南大学肿瘤研究所)惠赠。收集广东省佛山市南海区第五人民医院病理科存档的子宫颈病变组织149例。患者年龄25～70岁，平均43.5岁，其中慢性子宫颈炎25例，低级别子宫颈上皮内病变(cervical intraepithelia neoplasia, CIN)Ⅰ 31例，高级别CIN(CIN Ⅱ～Ⅲ、原位癌)33例，子宫颈鳞癌60例(包括30例高分化鳞癌，30例中、低分化鳞癌)。石蜡包埋标本均经病理检查明确诊断。

1.2 方法

1.2.1qRT-PCR法 5种细胞系的细胞培养于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液进行培养，当细胞融合80%～90%时，用胰酶消化、离心，利用TRIzol提取法提取细胞中总RNA(RPMI 1640培养基和新生小牛血清、胰蛋白酶、TRIzol均购自美国Invitrogen公司)，测定RNA的浓度、纯度，进行cDNA的制备，其中所需逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶及dNTP购自美国Fermentas公司，DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司。利用Primer 5.0软件对HPV16 E6序列进行设计，引物由上海生物工程公司合成：HPV16 E6上游引物序列：5′-CCACCCAGAAAGTTACCACA-3′，下游引物序列：5′-TGCAACAAGACATACATCGA-3′；β-actin上游引物序列；5′-CTACGAGCTGCCTG ACG-3′，下游引物序列：5′-CCTAGAAGCATTTGCG GTGG-3′。荧光定量PCR仪(美国Eppendorf公司)进行qRT-PCR扩增，具体条件：95 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，72 ℃终延伸10 min，重复35个循环。采用2-△△Ct法进行目的基因，即HPV16 E6 mRNA的定量分析。

1.2.25种细胞系中B7-H1蛋白含量的检测 按“1.2.1”方法培养细胞，当细胞融合达80%～90%时，提取细胞蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。采用Western blot法检测5种细胞系中B7-H1蛋白表达量，一抗B7-H1单克隆抗体(美国Abcam公司，稀释比1 ∶500)，二抗(美国Cell Signaling公司，稀释比1 ∶2 000)。反应结束后采用超敏型ECL化学发光底物试剂盒(上海炎熙生物公司)曝光、全自动化学发光免疫分析仪(美国Beckman公司)显影，以β-actin为内参，采用Image J软件对蛋白条带进行半定量分析，比较5种细胞系中B7-H1的蛋白含量。

1.2.3杂交捕获-化学发光法 HPV16 DNA标本高温水浴1 h变性后，取75 μL转移至相应的杂交微孔板，震荡孵育1 h，将杂交微孔板的液体转移至捕获微孔板对应的孔中，室温条件下震荡1 h；将捕获微孔板加入检测试剂孵育45 min，移除捕获微孔板中的检查试剂，洗涤6次后拍干；在捕获微孔板中加入底物试剂，在避光条件下孵育15 min，在化学发光免疫分析仪上读数，检测HPV16型核酸，检测Cut off值为1 pg/mL。检测结果以样本测量值/参考值的比值表示，比值≥1.0，结果为“阳性”；比值<1.0，结果为“阴性”。

1.2.4免疫组化 免疫组化SP试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新公司，采用免疫组化SP法检测子宫颈各组织中B7-H1的表达，B7-H1一抗浓度为1 ∶500，生物素标记二抗工作液37 ℃恒温箱孵育1 h，DAB显色、苏木精复染，脱水、透明封固。由两位病理医师采用双盲法独立阅片。

1.3 结果判断按阳性细胞所占比例进行评分[9]：阳性细胞数≤10%为0分、11%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分；按细胞染色强度进行评分：浅黄色为1分、黄色为2分、深黄或棕褐色为3分；将两项得分结果相乘：≤6分为低表达，>6分为高表达。

2 结果

2.1 HPV16 E6 mRNA在5种子宫颈细胞系中的表达qRT-PCR检测结果显示，HPV16 E6 mRNA在5种细胞系中的表达差异有统计学意义(F=144.334，P<0.001)；组间比较显示，HPV16 E6 mRNA在转染HPV16 E6基因而永生化的正常子宫颈上皮细胞系H8细胞中表达最高(P<0.05)；在Caski、SiHa细胞系中表达也增高，与正常子宫颈细胞HaCat比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而HPV18型感染的Hella细胞不表达HPV16 E6 mRNA(图1)。

图1 HPV16 E6 mRNA的相对表达量：与HaCat比较，*P<0.05

2.2 Western blot法检测细胞中B7-H1蛋白的表达Western blot法检测结果显示，B7-H1蛋白在Hella细胞中表达最强，在Caski、SiHa和H8中均有表达，且高于HaCat细胞(P<0.01，图2)。

图2 B7-H1蛋白在子宫颈细胞系中的表达：A.B7-H1蛋白的相对表达；B.Western bolt法检测B7-H1的表达；与HaCat比较，*P<0.01；1.Hella细胞；2.Caski细胞；3.SiHa细胞；4.H8细胞；5.HaCat细胞；β-actin.样本内参

2.3 子宫颈病变组织中B7-H1的表达及HPV16的感染率免疫组化结果显示，B7-H1阳性定位于上皮胞质和胞膜，部分淋巴细胞阳性(图3)。B7-H1在慢性子宫颈炎组织、CIN和子宫颈鳞癌上皮组织中的阳性率呈递增趋势，分别为28.0%、59.4%和80.0%，各组间差异有统计学意义(P<0.01)。高危型HPV16感染率在慢性子宫颈炎、CIN和子宫颈鳞癌组织中的阳性率逐渐增高，分别为20.0%、48.4%和85.0%，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

表1 各子宫颈病变组织中B7-H1的表达和HPV16的感染情况[n(%)]

图3 B7-H1在子宫颈病变组织中的表达：A.HPV阴性慢性子宫颈炎组织呈阴性；B.HPV阳性慢性子宫颈炎组织中呈阳性；C.CINⅢ组织中呈阳性，定位于细胞质；D.子宫颈鳞癌组织中阳性，定位于细胞质和间质淋巴细胞，SP法

2.4 B7-H1的表达和HPV16的感染与子宫颈鳞癌临床病理特征的关系本组结果显示：B7-H1与子宫颈分化程度密切相关，差异有统计学意义(P<0.01)；但与临床分期和淋巴结转移无相关性。HPV16感染与子宫颈鳞癌的分化程度和临床分期有相关性(P<0.05，表2)。

表2 子宫颈鳞癌中B7-H1的表达和HPV16的感染与临床病理特征的关系[n(%)]

2.5 CIN和子宫颈鳞癌中B7-H1表达与HPV16感染的关系64例CIN组织中B7-H1表达与HPV16感染共阳性者30例，共阴性者13例；B7-H1表达与HPV16感染有相关性(r=0.726，P<0.01)；60例子宫颈鳞癌组织中B7-H1表达与HPV16共阳性者42例，共阴性者10例(r=0.773，P<0.01)。B7-H1表达与HPV16感染有相关性(表3)。

表3 CIN和子宫颈鳞癌中B7-H1表达与HPV16感染的关系[n(%)]

3 讨论

子宫颈癌是病因较为明确的女性恶性肿瘤，其致癌环节为高危型HPV E6/E7原癌基因整合至宿主细胞DNA中，E6蛋白作用于p53基因，E7蛋白与Rb基因相结合，p53和Rb基因功能丧失使细胞凋亡受抑制，细胞发生异常增生，同时引发多途径生物信号通路及相关蛋白表达异常[10]。本组qRT-PCR结果显示，HPV16 E6 mRNA在转染HPV16 E6基因而永生化的正常子宫颈上皮细胞系H8细胞中表达最高，在Caski及SiHa细胞系中表达明显增高，在HPV18型感染的Hella细胞中不表达HPV E6 mRNA，证实H8、Caski及SiHa细胞系中，确实存在HPV16 E6的表达。

B7-H1是PD-1的配体，研究发现肿瘤细胞高表达B7-H1分子，通过PD-1途径诱导免疫细胞凋亡，使免疫细胞失去对肿瘤的杀伤作用，因此B7-H1/PD-L1信号途径在肿瘤免疫逃逸及维持外周组织免疫耐受中起关键作用[11-12]。本实验Western blot法检测结果显示，B7-H1在HPV18型感染的Hella细胞中表达最强，在SiHa、Caski和H8均有表达，在HaCat中表达缺失，B7-H1蛋白在肿瘤细胞系的表达，与正常细胞HaCat比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；提示B7-H1表达水平的差异与细胞整合HPV16、18状态有关。在机体子宫颈病变过程中，HPV16 E6、E7作为癌基因与p53、Rb等多种异常蛋白协同引发致癌效应，当细胞脱离活体组织致瘤微环境时，高危型HPV相关癌蛋白可作为刺激因子引起B7-H1表达；在SiHa(HPV16感染)和Caski(HPV16、18共感染)子宫颈癌细胞系中，B7-H1表达量明显增高，提示高危型HPV感染及其异常蛋白的协同可能是B7-H1高表达的原因之一。H8是转染HPV16 E6基因的正常子宫颈鳞状上皮细胞系，B7-H1在H8中高表达，提示细胞在感染并整合高危型HPV E6或E7基因初期就能引起B7-H1的高表达，以此逃避机体免疫监视，为HPV的持续感染创造条件。

另外，本组对B7-H1在子宫颈慢性炎、CIN和子宫颈鳞癌组织进行免疫组化检测，结果发现B7-H1在高危型HPV16阳性慢性子宫颈炎上皮组织、CIN和子宫颈鳞癌组织中表达，且与子宫颈鳞癌分化程度有关(P<0.01)，与临床分期和淋巴结转移无关(P>0.05)。此外，B7-H1在子宫颈鳞癌间质内也有散在细胞表达。B7-H1在无HPV16感染的慢性子宫颈炎上皮组织中不表达，但在感染高危型HPV的慢性子宫颈炎上皮组织中表达明显增高。同时B7-H1在慢性子宫颈炎、CIN和子宫颈鳞癌组织中与高危型HPV16感染密切相关(P<0.01)。B7-H1/PD-1信号通路激活使CTL凋亡或功能失调，失去对病变细胞的杀伤作用[13]。人抗肿瘤免疫机制中，CTL介导的细胞免疫发挥非常重要的作用，被激活的CTL通过T细胞受体(T cell receptor, TCR)与肿瘤特异性抗原识别释放各种因子(颗粒酶、穿孔素等)以杀伤肿瘤细胞[14]。以上结果提示，B7-H1是子宫颈鳞癌发生的早期事件，在高危型HPV阳性病变组织中，持续的病毒刺激促使B7-H1不断表达，而B7-H1在HPV感染初期表达有利于病变细胞发生免疫逃逸，并引发病毒诱导的恶性转化。Lyford-Pike等[15]在HPV相关口咽上皮肿瘤中发现B7-H1在细菌病毒易感染的扁桃体内陷隐窝深部的鳞状上皮处高表达，在靠近腔面的上皮不表达，提示组织深部的隐窝上皮相对于表面上皮具有不同的免疫微环境，也是病毒相关肿瘤的起始部位；这与本组B7-H1在部分HPV阳性的慢性子宫颈炎组织中表达结果一致。本实验发现低分化子宫颈鳞癌中B7-H1表达明显增高，提示B7-H1在低分化肿瘤中高表达可能与抑制淋巴细胞浸润，拮抗免疫因子的分泌，促使肿瘤细胞异质性转化，导致病情恶化有关。

研究发现B7-H1在胃癌[16]、乳腺癌[17]、卵巢癌[18]、肺癌[19]等多种肿瘤细胞中高表达，同时PD-1在间质T淋巴细胞中高表达，激活B7-H1/PD-1能增强肿瘤免疫反应共抑制信号，同时抑制肿瘤患者的T细胞活性，不能有效分泌各种杀伤性细胞因子，使肿瘤细胞发生免疫逃逸，促使肿瘤的生长、侵袭和转移[20]。现有研究发现在体外阻断肝癌微环境中B7-H1/PD-1抑制途径，可以恢复T细胞增殖活性，促进细胞因子分泌，使T细胞的功能逆转[21]。本组结果显示，B7-H1在高危型HPV阳性的子宫颈细胞系及子宫颈病变组织中高表达，提示高危型HPV及其相关蛋白可能是引起B7-H1蛋白表达的关键因素，同时B7-H1/PD-1信号通路被激活，抑制CTL对病变细胞的杀伤是HPV持续感染的因素之一。子宫颈肿瘤间质中存在大量与免疫有关的细胞，肿瘤的治疗不仅要针对肿瘤细胞，还需提高肿瘤微环境中免疫细胞的功能，子宫颈鳞癌中B7-H1/PD-1介导的肿瘤免疫逃逸机制值得我们进一步分析。