庄金宝，郭志鹏，孙婧婷，石 旭，曹 扬*

(吉林大学第一医院二部 1.检验科；2.呼吸科，吉林 长春130032)

膜性肾病(MN)是由免疫介导性炎症所致的肾损害，以肾小球损伤为主，是导致肾病综合征的一个常见病因，发病率仅次于IgA肾病及系膜增生性肾小球肾炎[1,2]。根据有无继发性原因，MN可分为继发性和原发性膜性肾病(IMN)。继发性MN患者存在明确的诱发因素，如病毒感染、用药及肿瘤等原因引起，而IMN的发病机制目前被认为是抗磷脂酶A2受体抗体识别并结合肾小球足细胞基底膜侧的固有抗原，二者形成免疫复合物后沉积在肾小球毛细血管上皮处，导致毛细血管基底膜弥漫性增厚，损伤足细胞，破坏肾小球滤过屏障，产生蛋白尿[3,4]。

免疫复合物的形成是由B细胞分泌的抗体介导的自身免疫反应，因此IMN的发生也被认为与B细胞功能异常有关。滤泡辅助性T细胞(Tfh)是一类CD4+CXCR5+的T细胞亚群，表面标记物有ICOS(CD278)、PD-1(CD279)、BCL-6、IL-21等，可在CXCL13的趋化下被募集到淋巴滤泡，通过与B细胞接触和(或)分泌细胞因子IL-21来促使B细胞分化为抗原特异性的浆细胞或者记忆B细胞，并协助激活B细胞，促进免疫球蛋白类别转换，维持长时间的体液免疫应答，是辅助B细胞功能的主要T细胞亚群[5,6]。已有研究证明，在如IgG4 相关性疾病等B细胞功能异常疾病中均发现Tfh的异常[7,8]，但是不同Tfh亚群在不同分期IMN患者中的比例及其改变尚未完全明确。本文将在根据IMN患者24 h蛋白尿进行分组，研究Tfh及其不同亚群在不同组别患者中的比例及它们与患者临床指标的相关性，为评估IMN疾病进展提供新指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院肾病科2019年1月-2020年2月间确诊的IMN患者39例，男性24例，女性15例；健康对照组(HC)18例，男性11例，女性7例。根据临床上对IMN患者的危险分级以及相应的治疗标准，以患者24 h尿蛋白定量为分组依据，将IMN患者分为A组(<4 g)、B组(4-8 g)和C组(>8 g)3组。志愿者均已排除患有糖尿病、肿瘤、病毒性肝炎或其他感染，以及近6个月内服用过内类固醇或细胞毒性药物，并排除过敏性紫癜肾炎、狼疮性肾炎、和原发性肾小球肾炎患者。IMN患者组以及健康对照组的具体临床指标见表1。

表1 IMN患者组及对照组临床指标参数

1.2 样本采集与分析

分别抽取患者及对照组志愿者清晨空腹静脉血5 ml，应用拜耳ADVIA 1650全自动生化分析系统检测甘油三酯、胆固醇、尿蛋白定量和血尿酸，并在显微镜下观察镜下血尿。

1.3 方法

1.3.1外周血单个核细胞(PBMC)的分离 取新鲜采集的肝素钠抗凝的外周血，1 200 rpm/min离心去除血浆，将等体积淋巴细胞分离液置于15 ml离心管中，随后吸取全血，沿离心管壁缓慢加至分离液上层，1 800 rpm离心30 min，用移液器将中间的白膜层(即单核细胞和淋巴细胞富集层)转移至另一个新的离心管中，经PBS洗涤2遍后用RPMI1640培养基调整细胞数为1.0×106/mL备用。

1.3.2外周血中Tfh细胞表型的流式鉴定 取分离的PBMC 100 μl加入流式管中，每个流式管中同时加入以下荧光标记抗体：anti-CD4-APC、anti-CXCR5-PerCP、anti-CD278-PE，anti- CD279-FITC，同型对照管加入相应的同型抗体，混匀后室温避光孵育30 min，经PBS洗涤2遍后弃上清，1%多聚甲醛固定，24 h内用FACS Calibur流式细胞仪检测，通过Flowjo软件分析CD4+CXCR5+Tfh及其两个亚群CD4+CXCR5+ICOS+Tfh、CD4+CXCR5+PD-1+Tfh在外周血中所占比例。

1.3.3IL-21+Tfh细胞比例的测定 将分离后的PBMC用RMI1640培养基调整细胞浓度至5×105/well，铺于24孔板，加入50 ng/mL PMA和1.0 μg/mL伊诺霉素，置于37℃孵箱，刺激2 h后加入BFA，继续培养4 h，随后收集细胞，加入PerCP-anti-CXCR5和APC-anti-CD4荧光抗体室温孵育30 min，再加入固定破膜剂和Alexaflour 647-anti-IL-21荧光一抗，室温避光孵育30 min，PBS洗涤后应用流式细胞仪检测CD4+CXCR5+IL-21+Tfh细胞的比例。

1.3.4ELISA方法测定血清中IL-21含量 根据IL-21 ELISA检测试剂盒说明书，设置标准品孔、待测样品孔和空白对照孔。在标准品孔中加入经倍比稀释的不同浓度标准品100 μl，在待测样本孔中加入经样本稀释液(样本稀释5倍)稀释好的待测样本100 μl，置37℃孵箱温育30 min，用洗涤液将孔板充分洗涤后加入酶标一抗工作液100 μl，37℃温育30 min，充分洗涤后每孔加入底物工作液100 μl，37℃避光显色15 min后将100 μl终止液加至每孔，15 min内用酶标仪在450 nm波长处测各孔吸光度(OD)值。以标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线，随后根据样本的OD值计算出其对应的浓度。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 IMN患者外周血循环Tfh细胞的比例分布特点

Tfh细胞表面标志分子为CD4和CXCR5，除此外Tfh常见的表面标志分子还有ICOS和PD-1。因此我们在不同分期IMN患者外周血中进行了总Tfh细胞(CD4+CXCR5+)及其两个亚群：ICOS+Tfh(CD4+CXCR5+ICOS+)和PD-1+Tfh(CD4+CXCR5+PD-1+)细胞的比例分布研究。在分离患者外周血单个核细胞后，与带不同荧光染料的anti-CD4、anti-CXCR5、anti-CD278(ICOS)和anti-CD279(PD-1)一抗共同孵育，随后利用流式细胞仪分析，各Tfh亚群的划分如图1所示。分析后结果表明，与HC对照组相比，Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh细胞比例在B组患者中明显升高，但是在C组患者中这三者的比例均明显下降，如图2所示。

图1 流式细胞仪分析各Tfh细胞亚群圈门示意图

*P<0.05

2.2 ICOS+/PD-1+Tfh比值在不同IMN分组中的变化

尽管外周血中Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh的比例在A组、B组患者中呈上升趋势，在C组中明显下降，但是我们发现，C组患者中ICOS+/PD-1+Tfh的比值却明显高于B组，而B组中该比值又高于A组(P<0.05)，如图3所示。提示，ICOS+/PD-1+Tfh比值可能与IMN疾病进展相关。

*P< 0.05

2.3 Tfh细胞内外IL-21的表达水平

由于IL-21是Tfh细胞分泌的效应因子，可参与调节B细胞分化与增殖[9,10]，因此我们对Tfh胞内及胞外IL-21的表达进行了检测。如图4所示，通过ELISA技术检测胞外IL-21水平，我们发现IMN患者组的血清IL-21表达均高于HC组(P< 0.05)，但其在3个患者组之间的表达没有明显差异。IL-21+Tfh细胞在IMN患者组中的比例均高于HC组，其中C组中的比例又明显高于A组和B组，但在A、B两组之间没有明显差异，如图5所示。

*P<0.05

*P<0.05

2.4 Tfh亚群比例与IMN临床指标的相关性

由于ICOS+/PD-1+Tfh比值和IL-21+Tfh在外周血中的比例在IMN患者中普遍升高，尤其在高危险患者组中，二者均明显上调，因此我们推测ICOS+/PD-1+Tfh比值和IL-21+Tfh比例可能与IMN疾病进展相关。通过Spearman检验分析二者与IMN患者24 h尿蛋白量之间的关系，我们发现IMN患者24 h尿蛋白量与ICOS+/PD-1+Tfh比值之间呈正相关(r=0.8325,P<0.05)，而与IL-21+Tfh比例相关性不显著(r=0.3825,P>0.05)，如图6所示。

图6 IMN患者24 h尿蛋白与ICOS+/PD-1+ Tfh比值的相关性

3 讨论

IMN大多数发展相对缓慢，并且存在自发缓解与加重两种趋势，患者肾功能在轻中度时能维持正常，一旦进行性发展将导致肾功能不全。因此，评估患者进展至慢性肾功能不全的风险，对IMN患者进行危险分级再进行治疗是针对IMN的重要治疗理念。作为一种由抗原抗体免疫复合物沉积引起的足细胞损伤性疾病，分泌抗体的B细胞异常激活是IMN发病及进展的重要病因，而辅助型的Tfh细胞则在促进生发中心形成以及辅助B细胞活化、增殖的过程中发挥重要作用。Kraaijeveld等[11]发现应用钙调磷酸酶抑制剂(他克莫司)抑制Tfh细胞后，B细胞分化也受到明显抑制。Zhang等[12]发现在新发MN患者中，浆细胞升高的同时也伴随Tfh细胞比例的上升。因此，我们需要进一步明确Tfh细胞在IMN疾病进展中的改变及其临床意义。

Tfh是CD4+CXCR5+的T细胞亚群，其表面其他的标志性分子如ICOS、PD-1等对Tfh的迁移、定位、分化、发育起着重要作用，Tfh表面标志分子表达异常可以提示其功能的改变[5,6]。ICOS是CD28家族成员，属于诱导性协同刺激分子，能够和B细胞上的CD278配体结合传递刺激信号，对于促进Tfh表达IL-21并协助记忆性B细胞的形成有重要作用，其被T细胞活化所诱导，因此也是T细胞激活的一个标志[13]。IL-21由Tfh细胞产生，能够诱导Tfh迁移、分化及表达ICOS，是Tfh存活及B细胞增殖分化过程中的关键因子[8-10]。PD-1也是CD28家族一员，但属于免疫抑制性受体，其与配体PD-L1结合后传递抑制性信号，可抑制T淋巴细胞增殖及产生细胞因子，减弱ICOS和IL-21对Tfh细胞的活化[14,15]。另外，PD-1一方面抑制B细胞的增殖、分化和Ig类型转换，但另一方面也能协助B细胞促进生发中心的形成[16]，因此PD-1在Tfh中的表达具有多方面功能，我们猜测这可能与PD-1表达的水平和时间点有关。

因此，本研究根据临床上对IMN患者危险等级的划分及治疗方案的区别，以24 h蛋白尿为分组标准，在不同疾病进展阶段的IMN患者中比较了Tfh细胞及ICOS+Tfh和PD-1+Tfh亚群在外周血中所占的比例及变化趋势。我们发现，Tfh、ICOS+Tfh和PD-1+Tfh在低度(A组)和中度危险(B组)患者中的比例呈上升趋势，并均高于健康对照组HC，然而在高度(C组)危险患者中这三者的比例却均下降，我们推断这可能与高度危险患者本身机体免疫功能明显下降有关。分泌至胞外的IL-21在IMN患者血清中含量均高于HC组，但患者组间并没有明显差异。IL-21+Tfh细胞比例在C组中的表达水平明显高于A组、B组和HC组，因此尽管高度危险患者体内Tfh及其亚群比例下降，但其中表达IL-21的Tfh比例却升高了，提示高度危险患者体内Tfh具有更好的促进B细胞增殖和活化的能力。另外，我们还发现ICOS+Tfh和PD-1+Tfh两者的比值随IMN的危险分级明显上升，这提示我们ICOS+/PD-1+Tfh比值可能与IMN疾病进展相关。随后我们对ICOS+/PD-1+Tfh比值与IMN患者24 h尿蛋白量做了相关性分析，证明其与IMN疾病进展相关。因此，定期在IMN患者中检测ICOS+/PD-1+Tfh比值有可能作为预测或评估IMN疾病进展的一个新指标。