张小雪,巫伟峰,傅振星,罗水鑫,吴少云,陈发兴

(1.福建农林大学园艺学院亚热带果树研究所，福建 福州 350002；2.中国科学院庐山植物园，江西 九江 332900；3.福建省农资集团公司，福建 福州 350001；4.连城县农业农村局，福建 连城 366200；5.连城县四堡镇人民政府农业服务中心，福建 连城 366205)

李是蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)多年生落叶树种，是世界重要的核果类果树[1].福建省是我国李的主要产区，其中，‘芙蓉李’(PrunussalicinaLindl.)原产于福建省永泰县，是福建省主栽李品种，已有700多年的种植历史[2]，因果实具有诱人的色泽、美味的口感、较高的营养成分而深受消费者喜爱[3].李焦叶症是近年福建省发生的一种具有较大威胁的李树病害，于2013年首次发现在福建省连城县四堡镇，因发病时叶缘呈烧焦状，严重时全树叶片干枯，呈暗褐色，极似被火烧过，故当地果农称之为“火烧叶”.该病蔓延、发展较快，在四堡镇大部分果园均有不同程度的发生，导致减产甚至绝收，对当地果农增产创收极为不利，也是我国李产业健康、良性发展的潜在威胁.关于焦叶症与土壤肥力指标的相关性，现有文献报道较少，研究李焦叶症与矿质元素含量间的关系对于通过矿质元素的补给与控制来协同防控焦叶症有重要意义.为了探究焦叶症的发病根源，前人曾进行一些探索.张计峰等[4]研究显示，高温，叶片Na+、Cl-的富集，土壤Cl-含量偏高导致了核桃焦叶病的发生；柏超等[5]研究表明，银杏焦叶症属生理性病害，由根部吸收和供给不足引起；陈伟[6]研究表明，皱叶菊苣焦叶症属于生理性病害，通过分析其与叶片重酚类物质含量、苯丙氨酸解氨酶活力、多酚氧化酶活力的关系表明，酶促褐变是导致焦叶症的主要内因；高瑞霞[7]研究表明，相对湿度是引起核桃焦叶症的主要原因，相对湿度越大，焦叶症发病越轻，焦叶症的发生可能还与光照强度、气温、土壤含水量、土壤盐碱度、灌溉用水含盐量、土壤养分等有关.此外，叶片的失绿、焦枯还与矿质元素的缺失或过剩有关[8].近年来在李的病害防治方面开展了大量的研究工作，大多集中在细菌及真菌的防治上[9-11]，而关于由矿质元素的缺失或不平衡引起的生理病害报道较少.目前，‘芙蓉李’焦叶症仍未见相关报道，其是否与矿质元素有关尚不清楚.因此，本研究采用电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma massspectrometry,ICP-MS)法对来自正常李树叶片及其土壤、患病李树叶片及其土壤的矿质元素进行检测，通过热图、聚类分析、t检验、主成分分析等方法分析了‘芙蓉李’焦叶症与矿质元素含量的关系，旨在为解析‘芙蓉李’焦叶症的发病原因提供参考依据，以尽早提出合理的防治措施.

1 材料与方法

1.1 材料来源

供试材料‘芙蓉李’来源于福建省连城县四堡镇.果园年平均气温17.8 ℃，年降雨量1 800～2 000 mm，年日照1 900 h，无霜期250 d，最高气温35.5 ℃.果园均为标准化栽培管理.1号果园(东经116°42′30″，北纬25°50′51″)为平地水稻田改造的果园，海拔514 m，其果园发病率达34.8%；2号果园(东经116°42′33″，北纬25°51′36″)为山地黄壤果园，海拔482 m，其果园发病率为32.1%.参照棉花枯黄萎病的分级标准[12]，依据李叶片的焦枯程度，将正常树(叶片发病率低于5%)、病树(叶片发病率超过20%，发病叶面呈褐色焦枯状)的果园样本进行矿质元素含量对比分析.

1.2 方法

1.2.1 样品采集 土壤取样时，在两果园均按“S”型选取正常树、病树各5株，在树冠滴水线下挖一个深40 cm的土壤剖面，在剖面上均匀采集深度为0～25、25～40 cm土层的土壤各250 g.土样带回实验室自然阴干后过筛，分装，送检测定.在采集土壤样品的20株李树中部，随机选择外围枝叶于东西南北4个方位上，各采2片叶，每株8片叶；正常树、患病树每1株作为一个重复，设5个重复.将所有叶片样品装入有孔的干净塑料袋中，当天运回实验室，洗净后，切取中部叶，用真空冷冻干燥机冻干保存待测.

1.2.2 样品处理及ICP-MS检测 样品处理及ICP-MS检测参照文献[13]的方法.取0.500 0 g样品干样于聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL浓硝酸，轻轻晃动消解罐，使样品完全浸没，在设定的条件下进行微波消解.微波消解完成后，自然冷却.开盖后，将消解液移至25 mL容量瓶中，并用去离子水少量多次洗涤消解罐内壁，合并洗涤液于25 mL容量瓶中，定容；同时作空白对照.元素含量的测定是将混合标准系列溶液、样液进行ICP-MS测定，采用标准曲线法定量，加入混合内标校正基体干扰、仪器信号的漂移.

1.2.3 数据分析 使用Orgin 2017软件进行数据统计及主成分分析.利用R语言pheatmap包进行热图及聚类分析.

2 结果与分析

2.1 ‘芙蓉李’焦叶症的发病症状

图1显示：‘芙蓉李’患病3～6 d时，叶尖呈水渍烫伤状；患病6～10 d时，症状沿叶缘蔓延，随后，叶尖、叶缘都呈焦枯状，叶片正背面均无黑粉、白粉、锈状物、霉状物等菌虫病征；重症期间，全株叶片几乎干枯，无色泽，呈暗褐色如被火烤过一般.患病影响了叶片正常的光合作用，导致当年果实减产、品质下降，同时树势亦出现明显弱化，影响翌年生长.发病在每年的5月份前后，严重的病株在感病2～3年后枯死.该病有易蔓延、发展较快、阶段式发展(病症先局部发生，后逐步发展至整株)的特点，同一叶片可二次感病.患病叶随着发病天数的增加病症加重.

A：正常叶片；B：患病3～6 d；C：患病6～10 d；D：重症期.图1 ‘芙蓉李’焦叶症的主要形态特征Fig.1 Main symptoms of ‘Furongli’ plum scorched leaves

2.2 ‘芙蓉李’正常叶片的矿质元素含量

根据‘芙蓉李’正常叶矿质元素含量平均值的大小可将检测的29种矿质元素分为极微量元素(含量小于或等于100 μg·kg-1)、微量元素(含量大于100 μg·kg-1，小于或等于1 000 μg·kg-1)、中量元素(含量大于1 000 μg·kg-1，小于或等于10 000 μg·kg-1)、大量元素(含量大于10 000 μg·kg-1).结果(表1)显示，正常叶片中的极微量元素有Sb、Hg、Ag、Li、Be、Cd、Mo、V、Tl，微量元素有Co、Sn、As、Se、Ni、Cr，中量元素有Pb、Cu、Ti，大量元素有K、Ca、B、Zn、Sr、Ba、Al、Na、Fe、Mn、Mg.来自不同果园‘芙蓉李’正常叶片的矿质元素含量存在一定的差异，Be含量的变异系数最大，达68.28%；Ni、Se、Pb含量的变异系数也大于40%；而Cr、Ca含量最稳定，变异系数分别为0.52%、0.53%；此外，Mg、K、Sb含量也较稳定，变异系数小于1%.

2.3 ‘芙蓉李’患病叶与正常叶的矿质元素含量比较

聚类分析(图2a)显示，‘芙蓉李’患病叶、正常叶分别单独成组，说明患病叶与正常叶的矿质元素含量具有明显差异.患病叶的Na、Mo、K、Cr、Al、Fe、Cd 7种元素含量高于正常叶，Ca、As、Hg、Mg、Tl、Sr、Ba 7种元素含量低于正常叶.t检验(图3)显示，正常组与患病组达到极显著差异(P<0.01)的元素有Ca、Cr，达到显著差异的元素有Mg、K、Mo(P<0.05).

2.4 ‘芙蓉李’患病土壤与正常土壤的矿质元素含量比较

聚类分析(图2b)显示，来自同一果园的土样聚在一起，说明不同果园土壤元素含量的差异大于患病引起的差异.对比患病李树土壤、正常李树土壤的元素含量发现，患病李树土壤的Ti、Ca、Hg 3种元素含量高于正常李树土壤，Mg含量低于正常李树土壤，但t检验显示均未达到显著差异.

表1 ‘芙蓉李’正常叶矿质元素的含量Table 1 Mineral element contents in normal leaves of ‘Furongli’ plum

a:叶片样品;b：土壤样品.图2 ‘芙蓉李’叶片、土壤中不同矿质元素含量的热图与聚类分析Fig.2 Heatmap and cluster analysis of mineral elements in leaves and soils of ‘Furongli’plum

2.5 ‘芙蓉李’叶片、土壤中不同矿质元素含量的主成分分析

叶片中矿质元素含量的主成分分析(图4a)显示，主成分1、主成分2分别代表了44.87%、37.18%的信息量，两者组成的二维分布图可代表82.05%的信息量.主成分1可将患病组与正常组区分开，主成分2可将1号果园叶样与2号果园叶样区分开，说明主成分1包含了较多患病组、正常组的差异信息.根据向量在主成分坐标轴的载荷量可知，Mo、Cr、K、Ca、Mg 5种元素含量在主成分1坐标轴上有较大载荷，其中，Mo、Cr含量与K含量呈正相关，Mg含量与Ca含量呈负相关，说明这5种元素可能与李树患焦叶症有关.

土壤中矿质元素含量的主成分分析(图4b)显示，主成分1、主成分2分别代表了69.76%、22.83%的信息量，二维主成分分布图可代表92.60%的信息量.主成分1可将不同果园土壤区分开，但两个维度均未能有效区分正常组与患病组，与聚类分析结果一致.

*表示差异达到显著水平(P<0.05)，**表示差异达到极显著水平(P<0.01).图3 ‘芙蓉李’正常叶片与患病叶片元素含量的比较Fig.3 Comparative analysis of mineral element contents in normal and infected leaves of ‘Furongli’plum

3 讨论与结论

已有研究表明，焦叶症是一种生理性病害[4-7,14-17]，且该病的发生与高温、干旱、盐害、矿质元素含量、相对湿度有关.蒯传化等[17]研究显示，当‘红地球’葡萄果际温度达到42.0～42.8 ℃时发生日灼.本研究中‘芙蓉李’焦叶症发病地的年平均气温17.8 ℃，最高气温35.5 ℃，该气温条件下发生日灼的可能性极低，因此排除气温引发当地‘芙蓉李’焦叶症发病的可能.高瑞霞[7]的研究也表明，温度对核桃焦叶症的影响不显著，而盐碱度高的果园，其焦叶症发生较重.本研究结果显示，‘芙蓉李’患病叶含有较高含量的Na，可能由土壤含盐量过高导致，表明土壤的高盐碱度也可能是‘芙蓉李’焦叶症的发病原因之一，但由于正常叶也含有较高含量的Na，表明其不是主要原因.聚类分析、主成分分析均表明，‘芙蓉李’患病叶与正常叶的矿质元素含量有明显差别，其中，患病叶与正常叶的Ca、Cr含量达到极显著差异，Mg、K、Mo含量也达到显著差异.以上说明，高温、盐害等因素并不是导致‘芙蓉李’焦叶症的直接原因，可能与矿质元素含量间的平衡关系更相关，这需要进行一步验证.

a:叶片样品;b:土壤样品.图4 ‘芙蓉李’叶片、土壤中矿质元素含量主成分分析的二维分布图Fig.4 Two dimensional distribution of principal component analysis of mineral element contents in leaves and soil of ‘Furongli’plum

本研究结果显示，Mo、Cr、K、Ca、Mg 5种元素含量与患病关联最大，其中，Mo、Cr、K含量与患病呈正相关，Mg、Ca含量与患病呈负相关.Mg是叶绿素的组成成分之一，缺Mg会阻碍叶绿素的合成，使叶片失绿变黄，严重时形成褐斑坏死[8].Ca具有维持离子平衡、细胞结构、膜功能的重要作用[18-19]，是细胞分裂和增长所必需的.核桃呈焦叶症时，叶片中的Na+、Cl-显著富集，而Ca含量急剧减少[4]，这一表现与‘芙蓉李’症状相近.另外，近年来化肥的大量使用，土壤中的有机质含量、有益菌群不断减少，加之Ca是难移动元素，土壤供给远远不能满足树体的需要.以上说明，患病叶中的Mg、Ca含量均显著低于正常叶可能是造成‘芙蓉李’焦叶症的原因之一.作物极易吸收过量的Mo，其过剩会使作物叶片出现白色不规则斑点，并凋萎落叶[20].Cr过剩导致魔芋除叶脉外的叶色变淡黄色，严重时出现明显的白色斑纹或白云状缺绿[20].但本研究未见患病叶出现Mo、Cr过剩引起的白色斑点或斑纹.叶片中的矿质营养直接来源于土壤[21].高瑞霞[7]通过研究土壤养分、盐分与焦叶症病情指数之间的关系时发现：速效K、有机质的含量与病情指数呈负相关，速效K、有机质的含量越高，病情指数越低；土壤盐分与病情指数呈正相关，土壤中的盐分含量越高，焦叶症越严重.由此可见，土壤中的矿质元素含量是焦叶症的重要成因之一.但从土壤矿质元素含量的分析结果来看，来自不同取样果园的土壤具有明显的矿质元素特征，导致聚类分析、主成分分析均无法区分正常组、患病组的土壤，但这并未说明焦叶症的发生与土壤无关，因为叶片的矿质元素来源于根系对土壤矿质元素的吸收.

综合本研究结果及前人报道表明，‘芙蓉李’焦叶症属于矿质元素间的不平衡所导致的生理性病害.尽管焦叶症在核桃、板栗、猕猴桃等植物上做了一定的基础研究，但目前其病因仍不清晰，李叶片焦枯作为一种新型生理疾病，研究基础更为薄弱.本研究探讨了李焦叶症与目前报道的29种矿质元素含量的关系，结果初步表明，李焦叶症与叶片中的Ca、Mg含量关系密切，叶片缺Ca、Mg加大了焦叶症发病的可能性，矿质元素失调导致的生理性缺Ca、Mg是病害发生的主要原因，这一结论为焦叶症的预防提供了实践指导.