杨万运，冷嘉琦，罗艳玲，韩瑞花，王智军

(山东威高药业股份有限公司，山东 威海 264210)

复方氨基酸注射液的飞速发展使得临床危重症患者得到良好的肠外营养支持，保证了机体的正氮平衡，促进了蛋白质的合成[1]。复方氨基酸(15)双肽(2)注射液是含有甘氨酰谷氨酰胺和甘氨酰酪氨酸及15种氨基酸的肠外营养注射剂。在放置和生产过程中会产生(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸、焦谷氨酸、环-(甘氨酰谷氨酰胺)等杂质。其中谷氨酸在受热过程中会脱水发生环化反应生成焦谷氨酸，甘氨酰谷氨酰胺发生氨基酸脱水缩合反应，生成环-(甘氨酰谷氨酰胺)[2]。焦谷氨酸具有一定的对谷氨酸等受体的阻断作用，也可能引起神经毒性和代谢异常，这些杂质的存在对复方氨基酸注射液的临床用药安全构成了潜在的威胁。

本文采用离子交换树脂[3]处理样品后再用HPLC法同时测定焦谷氨酸、环-(甘氨酰谷氨酰胺)和焦谷氨酸的含量。方法重现性好，准确度高，适用于复方氨基酸(15)双肽(2)注射液的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DV215CD电子分析天平(奥豪斯)；pHS-3C型(雷磁)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；离子交换柱(取Dowex 50W×8离子交换树脂适量，填充置内径为1.5cm的萃取小柱中，填充高度为7cm，用水淋洗并悬浮于水中)。

1.2 试药

样品：复方氨基酸(15)双肽(2)注射液；对照品：焦谷氨酸(厂家：西格玛)，环-(甘氨酰谷氨酰胺)(厂家：中检院)，(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸(厂家：自制)；磷酸二氢钠和磷酸均为分析纯，试验用水为水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：InertSustain AQ-C18(4.6×250mm,5μm)；流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(pH值=2.1)；流速：1.0mL/min；柱温：18℃；检测波长：205nm；进样量：50μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制

精密称取(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸对照品6mg，焦谷氨酸对照品17.5mg，环-甘氨酰谷氨酰胺对照品26.5mg，置50mL容量瓶中，用水定容至刻度，作为混合对照品溶液。精密量取2mL，加至离子交换柱(内径1.5cm，高7cm，，填料Dowex 50W×8经20mL水淋洗并悬浮于水中)，用水洗脱，收集洗脱液于100mL 容量瓶中，定容至刻度，摇匀即得混和对照溶液。同法配制单个杂质对照溶液。

2.2.2 供试品溶液与空白辅料的制备

分别精密量取复方氨基酸双肽注射液样品，空白辅料(液体制剂室提供)2mL加至离子交换柱内(内径1.5cm高7cm)，用水洗脱，收集洗脱液于100mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性考察

分别精密量取上述溶液各50μL，按2.1所述液相色谱条件分析检测。结果 表明溶剂及空白辅料的色谱图中(图1)，均无环-(甘氨酰谷氨酰胺)峰、(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸和焦谷氨酸峰，表明溶剂和空白辅料均不干扰测定；3种杂质与其他峰分离度均大于1.5，本色谱条件专属性良好。

自上至下，样品；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸对照溶液；混合对照溶液；空白辅料；溶剂

2.3.2 线性关系考察

称取焦谷氨酸氨酸、环-(甘氨酰谷氨酰胺)对照品适量，用水溶解，分别将溶液稀释成每1mL水中含环-(甘氨酰谷氨酰胺)约为2、4、6、8、10、12和15μg，含焦谷氨酸1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4和9.9μg，含(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸约为0.017、0.96、1.68、2.40、3.12和3.84μg的混合对照溶液。取上述溶液注入液相色谱仪中，记录色谱图。以进样量(μg)为X轴，以峰面积为Y轴进行线性回归，得环-(甘氨酰谷氨酰胺)回归方程y=2254343x+7301，r=1.000；焦谷氨酸回归方程：y=992116x+186.5，r=0.9999，见表1和图2；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸回归方程为y=50672x-187.89，r=1.000，结果表明：3种杂质的进样量与其峰面积均呈良好的线性关系。

表1 样品中焦谷氨酸线性结果

图2 焦谷氨酸线性图

2.3.3 定量限与检测限考察

分别称取3种杂质对照品适量，当环-(甘氨酰谷氨酰胺)进样量为0.318ng时，其峰高约为噪音的11倍，其定量限为0.29ng；环-(甘氨酰谷氨酰胺)进样量为0.095ng时，其峰高约为噪音的3倍，其检测限为0.095ng。焦谷氨酸进样量为0.281ng时，其峰高约为噪音的10倍，其定量限为0.28ng；焦谷氨酸进样量为0.084ng时，其峰高约为噪音的5倍，其检测限为0.05ng。(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸进样量为0.833ng时，其峰高约为噪音的9.8倍，其定量限为0.85ng；(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸进样量为0.25ng时，其峰高约为噪音的3倍，其检测限为0.25ng。

2.3.4 精密度试验

按照“2.2.2”中供试品溶液制备方法，平行制备六份样品，记录峰面积，测得六份样品中环-(甘氨酰谷氨酰胺)含量的RSD(n=6)为0.36%，焦谷氨酸含量的RSD为0.61%(n=6)，(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸含量的RSD(n=6)为0.14%。由不同的分析人员在不同时间、不同的仪器进行测定，平行制备六份样品，计算两人所得12份样品中3种杂质含量的RSD(n=12)均小于1%，表明本方法精密性良好。

2.3.5 加样回收率考察

精密称取3种杂质适量，加水制成每1mL含环-(甘氨酰谷氨酰胺)1.07mg，焦谷氨酸0.73mg和(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸0.3mg的混合对照品溶液，精密量取样品1mL加对照溶液0.5mL加至离子交换柱内(内径1.5cm，高7cm)，用水洗脱，收集洗脱液于100mL量瓶中，定容至刻度，摇匀即得。平行配制3份，作为70%回收率供试品溶液。精密量取样品1mL加对照溶液0.75mL。同上述方法，制得100%回收率供试品溶液，精密量取样品1mL加对照溶液1mL，制得100%加样回收样品溶液，每个浓度平行制备3份，计算回收率。试验结果表明：环-(甘氨酰谷氨酰胺)、焦谷氨酸和(S)-3-(3,6-二氧-2-哌嗪)丙酸的回收率均在98%～102%范围中，且回收率RSD%均小于1.5%，结果表明本法的准确度可靠。

3.2 离子交换柱对杂质检测的影响

取3种杂质对照品适量，加水溶解，得混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液适量，未过离子交换柱，分别制成50%，100%，150%的混合对照品溶液；同法取混合对照品储备液适量，加至离子交换柱内(内径1.5cm，高7cm，填料Dowex 50W×8经20mL水淋洗并悬浮于水中)，加水淋洗，收集流出液，分别制成50%，100%，150%的混合对照品溶液。

分别精密量取上述溶液各50μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，通过过柱前后相关物质的峰面积比值表现离子交换柱对杂质的吸附能力(见表2)。结果显示，过离子交换柱前后，3种杂质的峰面积均无显著性变化，表明离子交换柱对杂质无吸附性，本方法可准确检测本品中所含杂质。

表2 离子交换柱对杂质检测的影响

3.3 洗脱曲线

精密量取混合对照2mL，加至离子交换柱内，每5mL洗脱液接入一个试管中，分别取50μL进样，记录色谱图。结果表明环-(甘氨酰谷氨酰胺)(1)的平均过柱收率为98.51%，焦谷氨酸(2)的平均过柱收率为98.98%。通过测定洗脱液中各相关组分的峰面积，绘制洗脱曲线，从洗脱曲线可知，当供试品洗脱20次(约100mL)时，焦谷氨酸氨酸和环-(甘氨酰谷氨酰胺)几乎全部被洗脱下来，见图3，证明使用离子交换树脂进行吸附的方法可行。

图3 洗脱曲线图

3 结论

基于离子交换树脂可吸附多种氨基酸的原理来研究氨基酸类药物中特定相关物质的方法，此方法可有效去除多种氨基酸以降低对目标杂质的检测干扰。但尚无3种杂质的目标物质的检测方法和过柱后是否有残留的相关数据，本研究基于此，建立了相关验证方法，可直观确定目标物质经离子交换树脂后是否可以洗脱完全，与药物中其他氨基酸类成分分离完全。

研究结果表明本方法专属性强，重现性好，准确度高，灵敏度高，可用于复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中有关物质的测定，能有效地反应药品质量，适用于该药物的质量控制。