罗周正 张丽艳 李 贺 杜 波

（阜新市卫生健康服务中心（阜新市疾病预防控制中心）检验检测部，辽宁 阜新 123000）

流感病毒又被称之为流行性感冒病毒，在临床上属于极为常见的传染性疾病之一，且具有传播速度快、传染范围广及发病率高等特点，这与流感病毒极易发生变异有直接的关系。流感患者的主要临床表现为发热、头疼畏寒以及全身酸痛等症状，对患者的生理、心理造成了严重的影响，这一现象引起了社会的高度重视。为有效分离及鉴定流感病毒，有必要寻找一种精准、实用的监测方法，是预防及控制流感的关键[1]。因此，本研究对阜新市流感监测网络实验室进行检测的流感病毒样本分别实施实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术及细胞培养法，旨在探讨二者在流感病毒检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月至2018年12月阜新市哨点医院采集的4026份疑似流感咽拭样本作为研究对象，由专业病毒采样管进行操作，均于3 d内未服用过任何抗病菌药物的患者咽拭样本。以《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案》、《流行性感冒诊断标准》、《病原生物学检验-病毒》及《流行性感冒病毒》为参考依据。将以上所有咽拭样本及时送往流感监测网络实验室，将24 h内未能及时送检的样本放置在-70 ℃的冰箱中进行冷冻保存。

1.2 检查仪器及检测方法

1.2.1 仪器型号与试剂 ABI 7500 Fast荧光PCR扩增仪购自美国Thermo公司；核酸提取采用RNA病毒提取试剂盒RNeasy Mini Kit（德国QIAGEN公司，型号74104）；PCR反应试剂购自硕世生物科技有限公司；狗肾传代细胞由辽宁省疾病预防控制中心感染与传染性疾病防制所提供[2-3]。

1.2.2 样本采集与处理 采用核酸提取盒实时荧光定量PCR法提取样本。扩增条件为：1个循环50 ℃/30 min，95 ℃/5 min，95 ℃/10 s，45个循环，55 ℃/40 s，45个循环，采取羧基荧光素（FAM）信道在55 ℃下进行荧光检测[4-5]。

1.2.3 病毒细胞分离鉴定 将提取的样本病毒置入10000 U/mL双抗后，严密观察细胞病理形态变化，并采用红细胞凝集试验检测样本，若超过1∶16比例应结合红细胞凝集抑制试验检测及鉴定有关亚型血清[6-7]。

1.3 观察指标 统计两组研究期间流感病毒不同类型检测结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行分析。流感病毒不同类型阳性率等计数资料采用[n（%）]表示，组间比较行χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。两个连续变量间呈线性相关时，使用Pearson积差相关系数进行分析。

2 结果

2.1 两组流感病毒样本不同分型检测结果比较 研究组检出阳性样本512份。其中，检出新甲H1型149份，对照组分离毒株62株；研究组H3亚型206份，对照组分离毒株109株；研究组B型157份，对照组分离毒株97株，各组均未检出H5、H7、H9亚型。研究组检出阳性样本总数与对照组毒株总数呈正相关，且新甲H1型、H3型、B型与毒株分别呈正相关（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组流感病毒标本不同类型阳性率比较 研究组检出流感病毒阳性率为25.68%，对照组检出流感病毒阳性率为6.66%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2

表1 两组流感病毒样本不同分型检测结果比较（n）

表2 两组流感病毒标本不同类型阳性率比较[n（%）]

3 讨论

流感病毒的特点为潜伏期短、传染性强及容易发生变异，属于RNA病毒[8]。为此，加强流感的预防及控制，已成为众多学者需面临解决的首要问题。目前，针对流感病毒的检测方式有很多，包括胶体金快速检测、细胞培养等方法。其中，胶体金快速检测敏感度相对较低，往往无法单独用于诊断及筛查疾病中[9]。细胞培养法作为流感病原学监测的基础，是流感病毒检测最可靠的方式之一。但因其无法实现快速诊断的要求，未得以在临床进一步推广[10-11]。实时荧光定量PCR技术是1996年美国学者研发的一种新型技术，该技术不仅具备解决PCR污染的问题，同时还有较强的自动化程度及特异性，被临床誉为流感病毒检测的“金标准”[12]。实时荧光定量PCR技术可通过扩增至每一个循环产物荧光信号，促使荧光信号强度增强，经过一个循环后，被荧光强度信号收集，进一步通过荧光强度观察产物量的变化情况，最终建立荧光扩增曲线图[13-15]。

本研究结果显示，研究组检出流感病毒阳性率高于对照组（P＜0.05），由此可证实，实时荧光定量PCR法检测的准确性、灵敏度更高。但从根本上而言，细胞培养法的灵敏度相对较高，但因受样本采集时间、样本活病毒含量、样本运输以及保存要求差异等因素的影响，最终导致样本中具有感染狗肾代谢细胞活力的活病毒存在假阴性现象。而实时荧光定量PCR检测对象为病毒核酸，不管是活病毒还是病毒降解物，只需1～10 RNA拷贝数少量核酸即可迅速检出。

总而言之，根据流感病毒临床特点采用实时荧光定量PCR技术能够有效预防及控制流感大流行，可将其作为病毒筛查的一种行之有效的检测方法。