余丽金 许艳 崔红旺 温广宇

1.海南现代妇女儿童医院，海南 海口 570203 2.海南医学院第一附属医院，海南 海口 570102

绝经后骨质疏松是一种多基因调控的遗传性疾病，主要表现为骨脆性增加、骨组织微结构损坏、全身骨量降低[1]。骨质疏松病因与老龄化、环境、激素水平及遗传等多种因素有关，其中妇女进入更年期后，雌激素缺乏会使骨生长落后于骨吸收速度，进而造成骨密度(bone mineral density，BMD)大量流失，最终导致骨质疏松[2]。骨质疏松发病率呈逐年增高趋势，且极易造成骨折，对中老年人身心健康造成严重威胁[3]。卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)是垂体前叶嗜酸性粒细胞分泌的一种激素，能促进卵泡成熟，与绝经前后女性骨代谢调节有密切联系[4]。FSH受体(FSH receptor，FSHR)是FSH在体内发挥作用的主要途径，FSHR基因多态性会使得FSH空间结构发生改变，进而影响FSHR与其配体相互作用，进一步引起受体信息传递发生改变，最终影响FSH发挥作用[5]。目前关于FSHR基因多态性与骨质疏松相关性的研究较少，因此，本研究通过对FSHR基因外显子10上680位的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)进行探究，进而探讨FSHR基因多态性与绝经后骨质疏松症的关联性，以期为临床合理防治绝经后女性发生骨质疏松症提供一定理论依据，降低骨折发生几率。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年8月至2019年3月因骨质疏松于本院骨科住院的136例绝经后女性患者为研究对象(骨质疏松组)，平均年龄(62.87±6.12)岁；同期选取118例绝经后非骨质疏松女性作为对照(对照组)，平均年龄(64.23±9.24)岁。

收集患者入院时一般资料，包括年龄、绝经期年龄、绝经期年限、体质量指数(body mass index，BMI)、糖尿病、高血压等。骨质疏松患者纳入标准：①均符合中国人骨质疏松症诊断标准专家共识中对骨质疏松症的诊断标准[6]，诊断一般以骨密度下降、骨量减少及发生脆性骨折等为依据，发生脆性骨折即可诊断为骨质疏松，其中骨密度等于或低于同性别年轻健康成人骨密度峰值2.5个标准差(T-score≤-2.5 SD)；②绝经年龄≥40岁者；③无心脑血管等并发性疾病；④临床病理资料完整、清晰者。排除标准：①继发性骨质疏松者；②长期服用抗癫痫药物、雌激素、维生素D、肝素等影响骨代谢药物者；③伴有影响骨代谢疾病者，如骨肿瘤及营养不良；④伴有其他低骨量疾病者。本研究中所有患者均由两名及以上主治医师明确诊断。本研究经本院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准，所有受试对象及家人均由专业人员详细告知研究内容后自愿参加，并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

血液基因组DNA提取试剂盒(型号：DK604)，购自上海莱枫生物科技有限公司；PCR buffer Set(PCR buffer及MgCl2稀释液)(型号：11160010-1)，购自苏州瑞诺德生物科技有限公司；血清骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)ELISA试剂盒(型号：YM-QP11447)，购自上海远慕生物科技有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b)ELISA试剂盒(型号：SBJ-H1342)，购自南京森贝伽生物科技有限公司。UVP8000型凝胶成像分析系统，购自美国Millipore公司；HLC-723G8型全自动糖化血红蛋白分析仪，购自上海东曹生物科技有限公司；FAITH-1600型全自动生化分析仪，购自杭州中翰盛泰医疗器械有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1样品采集及保存：抽取两组女性清晨空腹外周静脉血样两份，其中一份置于含5% EDTA抗凝管中，用于提取外周血DNA；另一份置于促凝管中，经3 000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存。

1.3.2骨代谢、糖代谢及BMD相关指标测定：TRACP-5b、BALP采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法测定；糖化血红蛋白(HbA1c)采用全自动糖化血红蛋白分析仪测定；空腹胰岛素(FINS)采用全自动生化分析仪测定；BMD测定时所有研究对象均采取仰卧位，测定腰椎(L2～4)及左侧股骨颈两个部位，且均由同一技术人员操作。

1.3.3FSHR基因多态性检测：参照DNA提取试剂盒说明书提取两组女性外周血中DNA，核酸定量仪测定A260和A280，计算DNA纯度和浓度，并将浓度稀释到50 ng/μL，-20 ℃保存。PCR引物序列，上游：5‘GCAAGTGTGGCTGCTATGAA3’，下游：5‘GTGACATACCCTTCAAAGGC3’。反应体系共25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.8 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环。琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶成像仪分析，将单一明亮条带的PCR产物送上海生工生物工程公司纯化并测序，BLAST进行测序结果比对。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组年龄、绝经期年龄、绝经期年限、糖尿病患病比例、高血压患病比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)；骨质疏松组BMI显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较Table 1 Comparison of general data between the two groups

2.2 两组骨代谢、糖代谢及BMD相关指标比较

两组HbA1c、FINS比较，差异无统计学意义(P>0.05)；骨质疏松组TRACP-5b、BALP水平显著高于对照组(P<0.05)，腰椎BMD、股骨颈BMD水平显著低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组骨代谢、糖代谢及BMD相关指标比较Table 2 Comparison of bone metabolism, glucose metabolism, and BMD related indexes between the two groups

2.3 两组FSHR基因的SNP构成比较

结果显示，FSHR基因外显子10的680多态位点上有Asn680Asn(A/A)型(520 bp)、Asn680Ser(A/S)型(520 bp、413 bp、107 bp)、Ser680Ser(S/S)型(413 bp、107 bp)3种基因型(见图1)，其中对照组基因型中A/A型(占62.71%)最多，其次为A/S型(占20.33%)，S/S型(占16.96%)最少；骨质疏松组基因型中以S/S型(占59.56%)为主，其次为A/A型(占28.68%)，A/S型(占11.76%)最少。两组基因型比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组FSHR基因的SNP构成比较[n(%)]Table 3 Comparison of SNP composition of FSHR genes between the two groups [n(%)]

图1 680多态位点基因型检测Fig.1 Genotype detection of 680 polymorphism注：M：DNA laddar；1：A/A型；2：A/S型；3：S/S型

2.4 影响骨质疏松发生的多因素分析

将骨质疏松是否发生作为因变量，以FSHR的3种基因型(A/A型、A/S型、S/S型)、BMI、TRACP-5b、BALP、腰椎L2～4 BMD、股骨颈BMD为自变量进行Logistic回归分析，结果显示S/S型基因型、BMI是影响骨质疏松发生的独立危险因素，腰椎L2～4 BMD、股骨颈BMD是影响骨质疏松发生的保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响骨质疏松发生的多因素分析Table 4 Multiple analysis of factors influencing osteoporosis incidence

3 讨论

骨质疏松是一种骨质流失导致骨骼脆性增加的代谢性骨骼疾病，正常骨代谢周期中，成骨细胞不断形成新骨和破骨细胞，且不断吸收旧骨，构成动态平衡，当平衡打破时，骨形成速率低于破骨细胞的骨吸收速率，最终导致骨质疏松，患者有较高的骨折风险，且多发于绝经后女性群体中[7]。目前临床骨质疏松的诊断主要依靠BMD检查和临床症状，但BMD出现改变需6个月甚至1年以上时间，因此不能通过测定BMD值反映早期骨质疏松改变[8]。因此寻找一些与骨质疏松关联性较强的检测指标，可能比BMD检测更能快速地评估骨质疏松，且对防治女性绝经后发生骨质疏松有重要意义。

FSH是垂体前叶嗜酸性细胞合成并分泌的一种促性腺激素，FSH是维持卵泡发育、成熟的必需物质，同时也是最终引发排卵的重要物质[9]。而FSH只有通过卵泡颗粒的相应受体即FSHR介导才能进入靶细胞内发挥其作用，FSHR由胞外区、跨膜区及C-末端区构成，是G蛋白耦合受体超家族成员之一[10]。研究表明[11]，FSHR基因多态性与生殖有密切联系，然而在绝经后女性体内的研究较少，且并无出现与骨质疏松相关的研究。但目前有许多探究相关基因多态性与绝经后女性骨质疏松症关系的研究。马秋华等[12]研究发现，Klotho基因G395 A基因型GG在骨量正常组老人中分布频率显著高于骨质疏松组老人，可能与骨质疏松症有关。本研究结果显示，FSHR基因外显子10的680多态位点上有Asn680Asn(A/A)型、Asn680Ser(A/S)型、Ser680Ser(S/S)型3种基因型，其中对照组基因型中A/A型(占62.71%)最多，S/S型(占16.96%)最少；骨质疏松组基因型中以S/S(占59.56%)为主， A/S型(占11.76%)最少，两组基因型比较，差异有统计学意义。提示S/S纯合子基因型与骨质疏松可能有关，FSHR基因型的检测可能作为预测绝经后女性骨质疏松症的一项补充指标。

骨代谢指标TRACP-5b来源于破骨细胞，是一种反映骨吸收状况的指标[13]。BALP由成骨细胞生成，能够进入血循环并参与骨形成[14]。腰椎BMD、股骨颈BMD是反映骨质疏松症的有效指标，骨质疏松患者的骨折风险会随BMD降低而升高[15]。本研究结果显示，骨质疏松组TRACP-5b、BALP水平显著高于对照组，腰椎BMD、股骨颈BMD水平显著低于对照组。提示TRACP-5b、BALP、腰椎BMD、股骨颈BMD等指标与骨质疏松病情发生、发展密切相关，可以作为预测骨量减少、骨质疏松的参考指标。进一步研究发现，两组年龄、绝经期年龄、绝经期年限、糖尿病患病比例、高血压患病比例比较，差异无统计学意义；骨质疏松组BMI显著低于对照组。提示较高BMI值可能对机体起到保护作用，减少骨质疏松发生。Logistic回归分析，结果显示S/S型基因型、BMI是影响骨质疏松发生的独立危险因素，腰椎L2～4 BMD、股骨颈BMD是影响骨质疏松发生的保护因素。提示临床上可通过检测FSHR基因型，初步预测骨质疏松症发生。进一步提示老人需进行健康的生活方式、合理膳食、控制BMI值，减慢骨量的丢失速度，延缓并减少骨质疏松发生。

综上所述，FSHR基因多态性与女性绝经后骨质疏松发生有密切联系，临床上可通过检测FSHR基因型，对骨质疏松做出初步预测，以便尽早干预和控制，对预防原发性骨质疏松发生具有重要价值，同时为临床治疗骨质疏松开辟新思路和视野，但具体作用机制仍需进一步研究。