赵会纳,曾陨涛,雷 波,蔡 凯,蔡 斌,余世洲,余 婧,许本波

(1.贵州省烟草科学研究院,贵州 贵阳 550081;2.中国烟草总公司 贵州省公司,贵州 贵阳 550004;3.长江大学,湖北 荆州 434023)

烟碱、蛋白质、氨基酸、叶绿素是烟叶中的主要含氮化合物[1-2],这些化合物不仅具有重要的生理功能,还与烟叶品质密切相关[3-4]。烟碱和总氮等含量受生态、品种、栽培等多种因素的影响[4-5],其中生态条件的影响大于品种和栽培措施[5-6],而气候是最重要的生态因子[7]。贵州部分烟区在烤烟旺长期少雨寡日照,存在中度或重度伏旱,成熟后期低温多雨,对烟叶产质量造成了不利影响。调整移栽期是烟叶生产适应生态因子的关键措施[8],通过调整移栽期,合理利用气候资源,可以促进烤烟优质适产[9],减少不利气候对烟叶产质量的影响。

目前,已有一些关于移栽期对烟株生长、烟叶品质、经济性状影响的研究报道[8-12],但关于釆烤前烟叶含氮物质尤其是氨基酸和叶绿素的研究还鲜有报道。氨基酸具有重要的生理功能,参与调控烟草内的能量代谢和物质转化[2],如氨基酸参与构成酶、激素,转变成糖或脂肪,可以平衡氮含量[13]。天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸直接参与烟草根系内的烟碱合成代谢[14]。脯氨酸是一种重要的渗透调节物质,在逆境胁迫时积累增多[15-18]。此外,在调制过程中,游离氨基酸与糖发生棕色化反应,生成多种对烟叶香味品质有重要贡献的杂环化合物[4]。釆烤前正是烟叶落黄成熟即将收获时的状态,烟叶的光合能力迅速减弱但分解能力增强,叶绿素含量迅速降低,烟叶颜色由绿转黄,组织逐步变得疏松,烟叶内化学成分趋于协调,此时烟叶处于工艺成熟期,是成熟衰老过程中的一个阶段[19]。此外,烟叶中的烟碱、总氮含量在烘烤过程中变化不大[20-21],还可直接反映烤后烟叶品质。因此研究烟叶釆收时的基础物质组成和生理代谢具有重要意义。本试验采用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)法结合方差分析,筛选了不同移栽期烟叶的差异含氮物质,并将其与关键生育期的光、温和水条件进行了相关分析,探讨了影响差异含氮物质含量的气候因子,以期为烤烟移栽期的调整、优质烟叶种植环境的选择,以及烟叶的生理代谢研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种为K326,按当地优质烟栽培技术进行生产管理。试验在贵州省黔东南州天柱县平甫进行。

1.2 试验设计

设置3个移栽期处理:T1(3月31日移栽)、T2(4月28日移栽)、T3(5月31日移栽)。每个处理3次重复,小区随机排列。每个小区植烟80株(8行,每行10株),留叶数为每株18片。

1.3 样品采集

在中部烟叶成熟时,采集长势相同的烟株的中部烟叶(从下往上第9叶位),去除主脉后迅速放入液氮中带回实验室,每个处理取12片叶片,每4片烟叶混匀为1个重复,共3个重复,冷冻干燥后用于含氮物质含量的测定。3个移栽期烟叶样品的采集日期分别为7月19日、8月5日、9月6日。

1.4 含氮化合物含量的测定

烟碱[22]、蛋白质含量的测定[23]采用行业标准；可溶性蛋白质含量的测定采用南京建成科技有限公司的总蛋白测定试剂盒(考马斯亮蓝法)A045-2；氨基酸和铵离子含量的测定参照文献[24]中的方法。

1.5 数据分析

采用SPSS 16.0软件进行相关分析、方差分析和多重比较,其中多重比较采用Duncan氏法。采用Simca-p 13.0软件进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)。采用HemI 1.0.3软件进行热图分析。

2 结果与分析

2.1 不同移栽期的气象条件分析

由图1B可以看出,从3月下旬至9月上旬,气温总体呈先持续增加后小幅降低的变化趋势。由图1A可以看出：T1处理的烤烟从生根期到成熟期(3月31日～7月19日)的平均气温持续增加；T2处理的烤烟从生根期到旺长期(4月28日～6月26日)的平均气温持续增加,之后略有降低；T3处理的烤烟在3个关键生育期(5月31日～9月6日)的平均气温整体较高且平稳。

由图2B可以看出,从5月下旬至6月中旬,有明显降雨。由图2A可以看出：T1处理从旺长期到成熟期(5月5日～7月19日)平均日降雨量有明显增加；T2处理在旺长期(6月2日～6月26日)平均日降雨量较多,而在生根期(4月28日～6月1日)和成熟期(6月27日～8月5日)平均日降雨量较少；T3处理在旺长期(7月5日～8月4日)平均日降雨量较少,在生根期(5月31日～7月7日)和成熟期(8月5日～9月6日)平均日降雨量较多。

由图3B可以看出,从4月下旬至6月上旬,日照时数较少。由图3A可以看出：T1处理从生根期到旺长期(3月31日～5月29日)平均日照时数明显减少,之后至成熟期(5月30日～7月19日)有所增加；T2和T3处理从生根期至成熟期(分别是4月28日～8月5日和5月31日～9月6日)平均日照时数持续增加。

总降雨量的变化规律(见图4)和日降雨量的变化规律(见图2)一致。T1处理从旺长期到成熟期(5月5日～7月19日)的总降雨量有明显增加。T2处理在旺长期(6月2日～6月26日)的总降雨量较多,在生根期(4月28日～6月1日)和成熟期(6月27日～8月5日)较少。T3处理在旺长期(7月5日～8月4日)的总降雨量较少,在生根期(5月31日～7月7日)和成熟期(8月5日～9月6日)较多。

A图是3个移栽期处理在关键生育期的平均气温,其中生根期指移栽后0～35 d，旺长期指移栽后36～60 d，成熟期指移栽后61 d～成熟采收，下同。B图是3月下旬～9月上旬的气温。图1 不同移栽期的日均气温分析

A图是3个移栽期处理在关键生育期的平均日降雨量。B图是3月下旬～9月上旬的日降雨量。图2 不同移栽期的日降雨量分析

由图5B可以看出,4月下旬至6月上旬,总日照时数较少。由图5A可以看出,T1处理从生根期到旺长期(3月31日～5月29日)总日照时数减少,之后至成熟期(5月30日～7月9日)有较大幅度增加。T2和T3处理从生根期至旺长期(分别是4月28日～6月26日和5月31日～8月4日)总日照时数有小幅增加,至成熟期(分别是8月5日和9月6日)有较大的增加。

2.2 不同移栽期烤烟主要含氮化合物含量的差异分析

对中部烟叶样品的含氮物质数据进行了主成分分析(PCA),从图6可以看出,移栽期对烟叶含氮物质的影响较大,每个移栽期的样品各自聚在一起。采用偏最小二乘-判别分析并结合非参数检验筛选不同移栽期的差异含氮物质。

图6 中部烟叶含氮物质主成分散点图

A图是3个移栽期处理在关键生育期的平均日照时数。B图是3月下旬～9月上旬的日照时数。图3 不同移栽期的日照时数分析

A图是3个移栽期处理在关键生育期的总降雨量。B图是3月下旬～9月上旬的旬降雨量。图4 不同移栽期的总降雨量分析

采用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)法将3个移栽期处理烤烟样品的含氮物质数据进行两两比较,分别筛选出VIP>1.0的差异物质。由变量载荷图(图7)可以看出：T1和T2处理间烟叶的差异物质是总氮、烟碱、游离态烟碱、蛋白质、可溶性蛋白质、谷氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、叶绿素、苏氨酸、γ-氨基丁酸和蛋氨酸;T1和T3处理间烟叶的差异物质是叶绿素、精氨酸、蛋氨酸、游离态烟碱、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、组氨酸、精氨酸、缬氨酸和瓜氨酸；T2和T3处理间烟叶的差异物质是总氮、可溶性蛋白质、瓜氨酸、色氨酸、精氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、组氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、亮氨酸、丝氨酸、铵离子及苏氨酸。

2.3 移栽期对主要含氮化合物含量的影响

从方差分析结果(表1)可以看出,移栽期对中部烟叶的烟碱、总氮、可溶性蛋白质、叶绿素、谷氨酸等20种含氮化合物的含量有极显著的影响(P<0.01),对天冬氨酸、天门冬酰胺、苏氨酸、亮氨酸含量有显著的影响(P<0.05),对蛋白质和铵离子含量的影响不显著。

A图是3个移栽期处理在关键生育期的总日照时数。B图是3月下旬～9月上旬的旬日照时数。图5 不同移栽期的总日照时数分析

将P<0.01且VIP>1.0的差异含氮物质含量进行多重比较(表1),可以看出,T2处理烟叶的含氮物质(铵离子除外)含量均最低,其中烟碱、总氮、蛋白质、丝氨酸、天门冬酰胺、组氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、正亮氨酸和色氨酸含量均显著低于T1和T3处理的烟叶。

表1 初步筛选的差异含氮物质含量的方差分析和多重比较结果(VIP值>1.0)

2.4 含氮化合物与气象条件相关分析

由图8可以看出:在T1烟叶中含量较高的总氮、烟碱、游离态烟碱、叶绿素、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、丝氨酸与生根期的日照时数、总日照时数及成熟期的日降雨量、总降雨量呈显著正相关,与成熟期的日照时数和气温呈显著负相关;在T3烟叶中含量较高的可溶性蛋白质、组氨酸、缬氨酸、精氨酸、色氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、蛋氨酸与生根期的日降雨量、总降雨量以及成熟期的总日照时数呈显著正相关,与旺长期的日降雨量和总降雨量呈显著负相关。

A图为T1和T2间比较；B图为T1和T3间比较；C图为T2和T3间比较。图7 不同移栽期处理中部烟叶样品的含氮物质载荷图(Loadingplot)

图8 烟叶样品差异含氮物质与气象条件间的相关系数热图

3 小结与讨论

本研究结果表明：3月31日移栽的烟叶中的烟碱、叶绿素、脯氨酸、蛋白质含量较高,这些含氮物质与生根期的日照时数、总日照时数以及成熟期的日降雨量、总降雨量呈显著正相关,与成熟期的日照时数和气温存在显著负相关；5月31日移栽的烟叶中的烟碱、蛋白质和天冬酰胺含量较高,这些物质与生根期的降雨量以及成熟期的总日照时数呈显著正相关,与旺长期的降雨量存在显著负相关；4月28移栽的烟叶的烟碱和总氮含量较为适宜,分别为2.72%和1.84%,其蛋白质、叶绿素和多数氨基酸含量均较低。相关研究显示:烟叶的叶绿素在燃吸时会产生明显的青杂气和刺激性[25]。蛋白质和多数氨基酸含量与烟叶品质存在稳定的负相关关系[26]；蛋白质、脯氨酸和天冬酰胺对卷烟烟气中氰化氢和氨的累计贡献率接近90%,会影响烟叶的安全性[27-28]。因此,从烟叶的含氮物质含量和安全性来看,4月28日移栽对烟叶品质形成更为有利。这可能与4月28日移栽的气象条件有关,4月28日移栽的烤烟从生根期至成熟期的气温在21～25 ℃,在旺长期降水量较多,在成熟期日照时数较多,有利于烟株的生长和优质烟叶品质的形成[29-32]。3月31日和5月31日移栽的烤烟在需水量最多的旺长期降雨量较少,不利于烟株生长；而在成熟期降雨又较多，易造成烟叶贪青晚熟,烟叶的物质转化不充分,对烟叶产质量造成不利影响。因本试验为1年单点试验,所得结果可能还存在一定的局限性,因此今后拟结合初烤烟叶的化学成分、感官质量等,进一步探讨更有利于优质烟叶生产的适宜移栽期。