邓张双 黄 蓉 刘秀继 李知洪 姚 鹃 李 啸 杜维力 邹 坤 龚大春

(1. 华中科技大学同济医学院药学院， 武汉 430030； 2. 三峡大学生物与制药学院 中国轻工业功能酵母重点实验室， 湖北 宜昌 443002； 3. 安琪酵母股份有限公司研发中心， 湖北 宜昌 443003)

还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的三肽化合物，具有解毒[1]、抗氧化[2]、参与三羧酸循环及糖代谢[3]等多种生物活性，在药物、调味食品和化妆品等领域应用广泛，市场前景巨大．目前，还原型谷胱甘肽主要通过酵母发酵[4]、酶法合成[5]和化学合成[6]等方法制得，其中酵母发酵制备生产是常用工业化方法．因还原型谷胱甘肽含有的巯基异常活泼，制备过程中容易发生氧化反应形成二巯键生成分子间偶联产物氧化型谷胱甘肽(GSSG)，从而导致生物活性丢失．因此，如何克服还原型谷胱甘肽氧化，是个热点研究方向．目前关于还原型谷胱甘肽氧化过程和机制的研究工作更多是基于高纯度标准品开展[7]，实际生产制备受工艺条件、环境因子等因素影响，可参考价值有限．本文基于酵母发酵制备还原型谷胱甘肽工艺，针对生产线上酵母源富还原型谷胱甘肽溶液开展温度、pH、溶氧和外源抗氧化试剂对还原型谷胱甘肽稳定性的影响，初步阐明还原型谷胱甘肽降解机制，为酵母制备还原型谷胱甘肽工艺优化提供参考．

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酵母源富GSH溶液由安琪酵母股份有限公司研发中心提供，溶液pH值为2，GSH质量浓度为2～3 mg/mL．

GSH和GSSG标准品购自上海源叶生物科技有限公司；亚硫酸钠、抗坏血酸、抗坏血酸钠、植酸钠、连二亚硫酸钠、庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾购自国药集团化学试剂有限公司；二硫苏糖醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余试剂均为分析纯．

1.2 仪器与设备

LC3000Ⅰ型高效液相色谱仪、Waters XevoTQD三重四极杆液相质谱联用仪、AVANTI离心机(J-26XP)、HH-S24s数显恒温水浴锅、Auto Science抽滤机AP-01P、KQ2200型超声波清洗仪、METTLER TOLEDO电子天平、METTLER TOLEDO pH计及其他玻璃仪器．

1.3 方法

1.3.1 还原型谷胱甘肽HPLC检测方法[8]

流动相配制：庚烷磺酸钠2.2 g、磷酸二氢钾6.8 g加1 L纯化水溶解后调节pH 3.0，加入110 mL甲醇，膜过滤超声后待用．

检测条件：波长210 nm、柱温35℃、Venusil XBP C18色谱柱.

1.3.2 标准曲线的绘制

分别准确称取GSH和GSSG标准品40 mg，用少量纯化水溶解后定容至10 mL，配制成4 mg/mL的标准液．然后取5 mL标准液，用纯化水定容至10 mL，得到2 mg/mL的标准液．重复上述步骤分别得到1、0.5、0.25、0.05、0.01 mg/mL的GSH和GSSG标准液供HPLC分析．

GSH标准曲线方程：

y=8 823 800.677x+135 940.387 2(R2=0.999 3)

GSSG标准曲线方程：

y=12 970 305.63x+655 488.719 9(R2=0.999 1)

其中：x为样品质量浓度(mg/mL)；y为峰面积．

在0.01～4 mg/mL的范围内样品质量浓度与峰面积成线性关系，且线性关系良好．

1.3.3 温度对GSH稳定性的影响

用锥形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液，分别放置在4℃、25℃、50℃、75℃、100℃的水浴中，每隔2 h取样检测，计算GSH和GSSG的质量浓度变化．所有实验平行3次，取平均值．

1.3.4 pH对GSH稳定性的影响

用锥形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液，分别调节溶液pH值为2、3、4、5、6、7、8、9，室温(25℃)敞口放置，每隔24 h取样检测，计算GSH和GSSG的质量浓度变化．所有实验平行3次，取平均值．

1.3.5 溶氧对GSH稳定性的影响

用锥形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液，在室温(25℃)和自然pH的条件下，用空气泵通入空气，每隔1 h取样检测，计算GSH和GSSG的质量浓度变化．其中自然放置的样品设为对照．所有实验平行3次，取平均值．

1.3.6 抗氧化剂的添加对GSH稳定性的影响

用锥形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液8批次，分别加入过量(1 g)的抗氧化剂，分别调节溶液pH值至2～9，室温(25℃)敞口放置，每隔24h取样检测，计算GSH和GSSG的质量浓度变化．其中不添加抗氧化剂的样品设为对照．所有实验平行3次，取平均值．

1.3.7 抗氧化剂的添加量对GSH稳定性的影响

用锥形瓶取100 mL酵母源富GSH溶液10批次，分别按照溶液中GSSG质量浓度的0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0倍剂量添加抗氧化剂，调节pH值，室温(25℃)敞口放置，每隔24 h取样检测，计算GSH和GSSG的质量浓度变化．取未添加抗氧剂的溶液为对照组．所有实验平行3次，取平均值．

2 结果与讨论

2.1 温度对GSH稳定性的影响

如图1所示，随着温度的升高，溶液中GSH质量浓度逐渐下降，且温度越高，氧化程度越大．在4℃条件下，24 h后GSH氧化程度为27.5%；而在100℃条件下，24 h后GSH氧化程度达到89.8%．同时实验表明，在12 h内，4℃和25℃条件下，溶液中GSH质量浓度差异性不大．因此，本文后续实验采取室温操作．

图1 温度对GSH稳定性的影响

2.2 pH对GSH稳定性的影响

由图2可知，在pH 2～9范围内，随着溶液pH值的增加，溶液中GSH质量浓度逐渐下降，且pH值越高，氧化程度越大．在pH 6～9范围内，8 d内GSH基本全部氧化，氧化程度达到98.9%～99.4%；在pH 3～5范围内，8 d内GSH氧化程度达到82.1%～92.9%；在pH为2条件下，氧化速度减缓，8 d内氧化了约51.9%．因此，溶液pH值越低越利于GSH的保存；短期内(1～2 d)保藏富GSH的溶液，宜调节溶液pH值为2．

图2 pH对GSH稳定性的影响

2.3 溶氧对GSH稳定性的影响

如图3所示，往富GSH的溶液中通入空气的时间越长，溶液中GSH质量浓度下降越快，在4 h后，溶液中GSH几乎全部氧化，氧化程度达94.2%．而作为对照组(不通空气)，仅有少量GSH氧化．因此，富GSH的溶液宜采用真空保存或采用惰性气体保护．

图3 溶氧对GSH稳定性的影响

2.4 抗氧化剂的添加量对GSH稳定性的影响

筛选了植酸钠、抗坏血酸、抗坏血酸钠、连二亚硫酸钠、亚硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)6种常见的抗氧化试剂用于溶液中GSH氧化反应阻断实验．如图4所示，添加植酸钠后的3 d实验中，溶液中GSH呈现高pH导致的氧化反应，未起到抑制氧化发生的效果．而且，添加抗坏血酸、抗坏血酸钠、连二亚硫酸钠3种试剂后的效果与此一致．

图4 添加植酸钠对GSH稳定性的影响

如图5所示，在富GSH溶液中添加亚硫酸钠后，在pH 2～6范围内，短期内(1～3 d)有明显抑制GSH氧化的效果，但未能完全阻断氧化反应发生，这可能与亚硫酸钠的过量添加有关；在碱性条件下，反而加速氧化．结合溶液中GSSG质量浓度分析，亚硫酸钠最优添加pH值为5.0．

图5 添加亚硫酸钠对GSH稳定性的影响

如图6所示，在富GSH溶液中添加二硫苏糖醇(DTT)后，在pH 2～7范围内(特别是pH 6的条件下)，能完全阻断氧化反应发生，并由GSSG逆向反应生产GSH，提升溶液中GSH的质量浓度，且3 d内GSH质量浓度稳定；但在碱性条件下，DTT并不能抑制氧化反应发生，最优添加pH值为6.0．

图6 添加二硫苏糖醇对GSH稳定性的影响

DTT是一种常见的还原剂，常用于巯基化DNA的还原和去保护，其还原由两步连续的巯基-二巯键交换反应完成，最终生成DTT的环状氧化结构．

2.5 抗氧化剂的添加量对GSH稳定性的影响

按照溶液中GSSG质量浓度的0.5～5.0当量比例添加亚硫酸钠，结果见表1．相比对照，按照时间纵向比较，适当添加亚硫酸可以抑制还原型GSH发生氧化反应，维持GSH质量浓度在试验天数(5 d)内基本稳定；过量添加亚硫酸可致GSH发生降解反应，GSH质量浓度降低．且最佳添加倍数为溶液中GSSG质量浓度的1.5～4.0倍．按照时间横向比较，放置1 d，最佳添加量为0.5倍；放置2 d，最佳添加量为1.0；放置3 d，最佳添加量为2.0倍；放置4 d或5 d，最佳添加量为3.5倍．依此，可维持GSH在响应时间内质量浓度不发生变化．

表1 添加不同比例的亚硫酸钠对溶液中GSH质量浓度(mg/mL)的影响

按照溶液中GSSG质量浓度的0.5～5.0当量比例添加DTT，结果见表2．相比对照，添加DTT后24 h内能有效提升GSH溶液中GSH的质量浓度，且随着添加倍数的增加，GSH质量浓度逐渐增加，主要是DTT能使溶液中GSSG逆反应生成GSH所致．但是随着时间延长，参与反应的DTT消耗殆尽，则GSH的质量浓度重新呈现下降趋势．因此，短时间(1～2 d)内保藏GSH，应按照溶液中GSSG质量浓度的1.0～5.0倍添加DTT较为合适．具体添加策略为：放置1 d，最佳添加量为>1.0倍；放置2 d，最佳添加量为>1.5倍；放置3 d，最佳添加量为>3.5倍．

表2 添加不同比例的DTT对溶液中GSH质量浓度(mg/mL)的影响

2.6 GSH氧化降解产物及杂质鉴定

采用LC-MS对酵母源富GSH溶液进行杂质鉴定，根据分子量推测鉴定4个杂质，分别为GSH[O]、L-谷氨酸-L-半胱氨酸-α-丙氨酸、GSSG和PGA．GSH在溶液中极不稳定，本文推测GSH质变机理如图7所示，GSH通过酰胺键断裂，氨基酸缩合、聚合和氧化等反应生成系列质变化合物．首先GSH通过酰胺键断裂降解为H-半胱氨酸-甘氨酸-OH(Cys-Gly)和谷氨酸(Glu)以及OH-半胱氨酸-谷氨酸-H(Cys-Glu)和甘氨酸(Gly)；H-半胱氨酸-甘氨酸-OH发生氧化生成(CG)2，谷氨酸发生缩聚反应生成聚谷氨酸(PGA)；H-半胱氨酸-甘氨酸-OH进一步断裂酰胺键生成半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)；半胱氨酸巯基发生氧化形成Cy2，甘氨酸与半胱氨酸缩合生成H-甘氨酸-半胱氨酸-OH(Gly-Cys)；H-半胱氨酸-甘氨酸-OH(Cys-Gly)与GSH缩合形成GSH-CG．另外值得注意是，巯基在氧化剂(氧气)存在的情况下，可发生反应生成亚砜[9]，是否深度氧化生成砜和磺酸，需要深入试验验证．

专利文献报道[10]，欧洲药典9.0(European Pharmacopoeia 9.0)中对GSH的杂质检查项下，规定了4个已知杂质和1个未知杂质，已知杂质为Cys-Gly、Cys、Cys-Glu和GSSG，未知杂质可能为L-谷氨酸-L-半胱氨酸-α-丙氨酸，产生来源可能是微生物在生产GSH时，末端甘氨酸被α-丙氨酸取代，非GSH质变产生．本文从分子量上检测并推测该杂质的存在，且保留时间与GSH接近，后续需要从发酵工艺和化合物结构鉴定等方面作进一步确证．

图7 GSH溶液质变机理推测

3 结 论

还原型谷胱甘肽(GSH)结构中位于半胱氨酸上的巯基与其抗氧化、解毒等重要生理活性直接相关．在工业生产中和自然保存的条件下，巯基易发生二巯键形成的氧化反应，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)．

温度、pH、溶氧是化学物质生产和保存中普遍面临的致变因子．本文研究表明：溶氧对GSH氧化影响最大，4 h左右，溶液中GSH几乎全部氧化，氧化程度达94.2%；温度影响次之，100℃条件下，24 h后GSH氧化程度达到89.8%；在pH 6～9的条件下，8 d内GSH基本全部氧化，氧化程度达到98.9%～99.4%．因此，低pH值(pH 2.0)、低温(4℃)和无氧条件有利于GSH的稳定．

添加外源抗氧化试剂是阻断氧化反应发生的常规技术手段．本文筛选了植酸钠、抗坏血酸、抗坏血酸钠、连二亚硫酸钠、亚硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)6种抗氧化试剂，结果可以归纳为3种：①一类抗氧化剂为植酸钠、抗坏血酸、抗坏血酸钠和连二亚硫酸钠，既不能逆还原GSSG，也不能抑制GSH氧化降解；②一类抗氧化剂为亚硫酸钠，低剂量添加下能减缓GSH氧化速度，在最佳添加剂量下(溶液中GSSG质量浓度的3.5或者4.0倍，pH值为5.0)，能一段时间内维持GSH质量浓度稳定．但是过量添加则导致GSH迅速氧化，GSH质量浓度下降；③一类抗氧化剂为二硫苏糖醇，通过逆还原GSSG来阻断GSH氧化．

在GSH质变过程中，主要质变产物还是GSH氧化所致，即GSSG的形成．加强环境因子控制，特别是pH、溶氧、温度，可有效减缓GSH的氧化．