糖肾煎对2型糖尿病肾病大鼠的肾保护实验研究

2020-11-20晏玲胡爱民张利芳

世界中医药 2020年18期

晏玲胡爱民张利芳

摘要目的：探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病（DN）大鼠的肾保护作用。方法：采用单肾切除+高脂饲料+小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射，结合行为干预（饥饱失常、劳逸无度、惊吓）建立2型DN气阴两虚型证大鼠模型，共60只。按照随机数字表法随机分为A组（假手术）、B组（模型）、C组（糖肾煎）、D组（贝那普利），每组15只。检测各组大鼠干预处理后血糖[空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（PBG）]、尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）、24 h尿白蛋白（24 h-UAlb）、胱抑素c（Cys-c）及血、尿β2微球蛋白（β2-MG），比较各组大鼠肾组织病理特征。结果：与A组比较，B组BUN、Cr升高并不显著（P>0.05），FBG、PBG、24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG均明显上升（P<0.05）;与B组比较，C、D组24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG均有明显降低（P<0.05）;C、D 2组上述指标差异无统计学意义（P>0.05）;肾脏组织病变程度由正常～严重依次为A组、C组、D组、B组。结论：中药复方糖肾煎能有效降低2型糖尿病肾病大鼠的血糖、24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG，发挥肾保护作用。

关键词 2型糖尿病肾病;大鼠模型;气阴两虚型;糖肾煎;血糖;血清胱抑素C;β2微球蛋白;肾保护

Abstract Objective：To explore the renal protective effects of Tangshen Decoction on type 2 diabetic nephropathy（DN）rats.Methods：A total of 60 type 2 diabetic nephropathy rats with deficiency of both qi and yin were established by single nephrectomy，high fat diet and small dose of streptozotocin（STZ）intraperitoneal injection combined with behavioral intervention（hunger and satiety disorder，excessive work and rest，fright）and were randomly divided into a group A（sham operation），a group B（model），a group C（Tangshen Decoction）and a group D（benazepril），with 15 rats in each group.Fasting blood glucose（FBG），2 h postprandial blood glucose（PBG），urea nitrogen（BUN），serum creatinine（CR），24-hour urinary albumin（24 h UAlb），Cystatin C（Cys-C），blood and urine β 2-microglobulin（β 2-mg）were detected after intervention.The pathological characteristics of renal tissue were compared between the 2 groups.Results：Compared with group A，BUN and Cr in group B did not increase significantly（P>0.05），FBG，PBG，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine β2-MG increased significantly（P<0.05）; compared with group B，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine β2-MG in group C and D decreased significantly（P<0.05）; the above indexes in group C and group D had no statistical significance（P>0.05）; renal tissue lesions from normal to severe were A group，C group，D group，B group.Conclusion：Tangshen Decoction，the Chinese patent medicine can effectively reduce blood sugar，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine group β2-MG in type 2 diabetic nephropathy rats，and has protective effects on early DN kidney.

Keywords Type 2 diabetic nephropathy; Rat model; Deficiency of both qi and yin; Tangshen Decoction; Blood glucose; Serum cystatin C; β2-microglobulin; Renal protection

中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.005

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病的常见并发症，也是导致终末期肾病的重要原因，全国调查慢性肾功能衰竭的主要病因，糖尿病因素居第2位。绝大部分早期肾损害患者无临床症状或缺乏特异性，尿常规检查和肾功能检查也多无异常，给早期诊治带来较大困难。近些年有研究表明在DN早期，血清胱抑素c（Cys-c）与血、尿β2微球蛋白（β2-MG）上升更早于血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），可作为早期DN诊断及疗效评价的敏感指标[1]。目前尚无治疗DN的特效疗法，临床常用的有运动、饮食疗法、预防“3高”（血压、血糖、血脂）等治疗和预防方法，但疗效不尽理想，因此关于早期DN的治疗方案探究一直是临床研究的热点[2]。糖肾煎是治疗2型糖尿病肾病的经典方剂，临床相关文献也较多，但对于其肾保护作用机制有待深入探讨，此外相关病理观察方面的报道也较少。本研究建立早期2型糖尿病肾病气阴两虚病证结合实验模型，探讨运用中药复方糖肾煎对2型DN大鼠血糖、BUN、Cr、24 h尿白蛋白（24 h-UAlb）、Cys-c及血、尿β2-MG的影响，评价糖肾煎糖肾煎对2型糖尿病肾病的治疗作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物本次实验共收集SPF级Wistar雄性大鼠共60只，体质量大鼠100～130 g，平均体质量（114.5±10.6）g，均购自湖北省疾病控制中心实验动物中心[动物许可证号：SCXK鄂2016-0150，伦理审批号：医研伦审（2016）第04号]，基础饲料饲养，饮用消毒无菌水。

1.1.2 药物糖肾煎由生黄芪、太子参、生地黄、山药、山茱萸、茯苓、牡丹皮、五味子、赤芍、三七等中药组成，用“水煮醇提法”制备成浸膏，用生理盐水稀释成含生药2.5 g/mL的溶液。贝那普利（诺华制药，国药准字20000292），10 mg/片。脂饲料配制：按照基础饲料87.5%、猪油10%、胆固醇粉2%、胆酸钠粉0.5%0.5%的比例混合配制。

1.1.3 试剂与仪器血糖检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20091201）;BUN、Cr检测试剂盒（北京恩济和生物有限公司，批号：A141201、A141203）;β尿2-MG试剂盒（深圳新产业生物医学工程股份有限公司，批号：031150115）;尿微量白蛋白（umAlb）试剂盒（山东博科生物产业有限公司，批号：20141205E）。稳豪血糖仪（强生公司，美國，型号：one Touch Ultrall），全自动生化分析仪（雅培公司，美国，型号：CD-1600），显微镜（奥林巴斯公司，日本，型号：BX-51）和图像采集系统（奥林巴斯公司，日本，型号：DP70）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 60只大鼠适应性喂养7 d后进行血糖、血压、血脂、体质量等常规测量，均确保无指标异常大鼠。随机选取其中15只大鼠作为A组（假手术），余下45只作为模型制备对象，分成B组、C组和D组15只。参考文献[3-4]建立2型糖尿病肾病“气阴两虚证”大鼠模型，具体方法：1）单肾切除：除A组外，大鼠常规1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉消毒后，行背部切口1.5 cm，剥离肾脏脂肪、肾上腺，左肾门血管结扎，切除左肾后缝合切口，术后常规处理。A组行切口后仅暴露左肾、缝合切口处理。2）高脂饲料：除A组外，单肾切除术后7 d给予高脂饲料正常喂养，A组给予基础饲料喂养，持续2周。3）链脲佐菌素（STZ）腹腔注射：除A组外，均给予STZ 30 mg/kg腹腔注射，A组注射等剂量0.1 mmol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。72 h后行OGTT试验，血糖仪检测FBG≥5.6 mmol/L或负荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L表示模型初步建立。4）行为干预：除A组外，采用饥饱失常、劳逸无度、惊吓刺激等途径干预。

1.2.2 干预方法 A组继续常规饲养。C组给予中药复方糖肾煎10 g/（kg·d）灌胃。D组采用贝那普利（诺华制药）10 mg/（kg·d）灌胃处理，用生理盐水稀释成2 mg/mL的溶液灌胃。A、B2组给予饮用纯净水灌胃处理，灌胃纯净水体积同C、D 2组灌胃药液体积，4组均连续灌胃处理20周。若研究中途有大鼠死亡则予以剔除。

1.2.3 检测指标与方法均于实验结束前1 w采用金属代谢笼收集24 h尿标本，记录尿量后取10 mL尿标本。OGTT实验结束后禁食12 h，以戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉取血，分离血清，以备检测。血糖（FBG、PBG）测定用葡萄糖氧化酶法;BUN用尿素酶-谷氨酸脱氢酶法;Cr用酶法;umAlb用免疫透射比浊法;血、尿β2-MG用化学发光法;Cys-c用免疫比浊法，所有指标均严格按试剂盒说明书进行检测。剥离摘取大鼠右侧肾脏，冰生理盐水清洗后吸干表面水分，10%福尔马林固定72 h，制备4 μm石蜡切片，苏木素伊红（HE）染色，光镜下观察各组大鼠肾组织病理特征。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，先对计量资料进行正态性检验，当满足正态分布和方差性时，组间比较采用t检验，若当不满足正态分布则采用非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验模型大鼠基本情况 A组大鼠体态正常，进食、饮水、排泄、运动、睡眠等均正常，无死亡;B组大鼠体态衰弱，毛发稀少枯黄，四肢纤瘦乏力，少动嗜睡，排泄习惯及排泄物形态异常，死亡2只;C组大鼠体态稍次于A组，明显优于B组，大鼠进食、饮水、睡眠习惯、排泄等基本正常，毛发略有干枯，颜色略微黯淡，运动量稍有减少，死亡1只;D组大鼠体态次于A组、C组，优于B组，大鼠进食、饮水、运动量有一定减少，排尿次数增多，毛发干枯稀少，毛发枯黄，四肢纤瘦乏力，死亡2只。

2.2 4组大鼠FBG、PBG指标比较和A组比较，B、C、D组血FBG、PBG均显著偏高，差异均有统计学意义（P<0.05）;和B组比较，C组血FBG、PBG明显偏低，差异有统计学意义（P<0.05），和D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 4组大鼠肾功能BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG指标比较和A组比较，B、C、D组BUN、Cr均有升高，但差异均无统计学意义（P>0.05），B、C、D组24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG均显著偏高，差异有统计学意义（P<0.05）;和B组比较，C、D组24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见表2、表3。

2.4 4组大鼠肾组织病理特征 A组大鼠光镜下清晰可见肾小管、小管间质区结构，肾小管上皮细胞大小及排列均正常，基底膜完整等。B组可见局部肾小管间质纤维化，并伴有明显炎性细胞浸润和肾小球系膜细胞增生，肾小管上皮细胞可见脱落和颗粒变性等。C组可见肾小管、小管间质区结构等基本正常，伴有部分肾小球系膜细胞轻度增生和、少量肾小管上皮细胞颗粒变性。D组可见局部肾小管间质轻度纤维化和炎性细胞浸润，伴有肾小管水肿、细胞颗粒变性和肾小球萎缩等。各组大鼠肾组织病理特征由正常～病变严重顺序依次为A、C、D、B组。见图1。

3 讨论

DN的发病机制目前尚不明确，早期进行有效诊治可延缓病情的进展。血清Cys-c是半胱氨酸蛋白酶抑制剂，主要由机体所有有核细胞产生。循环中的Cys-c可经肾小球自由滤过，在近端肾小管上皮细胞被完全分解，肾脏是唯一清除Cys-c的器官，因此血清Cys-c是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物[5]。研究表明血清Cys-c与肾小球滤过率（GFR）呈良好的线性关系，且早于、优于Cr，检测血清Cys-c可明确DN的进展情况[6]。β2-MG由淋巴细胞等合成并分泌到血液及体液中，血液中的β2-MG可以从肾小球自由滤过，99.9%在近端肾小管吸收，并在肾小管上皮细胞中被分解[7-8]。当肾小球滤过功能下降时，血β2-MG开始升高，因而能够及时反映肾小球滤过功能的损伤[7];当肾小管功能发生异常时，重吸收功能下降，尿β2-MG含量升高[9]，因而尿β2-MG是诊断肾小管功能损伤尤其是近曲小管功能损伤的敏感性指标。李波等[10]的临床试验结果显示血清Cys-c、β2-MG比Cr、BUN能更敏感、更准确的反映GFR，对早期诊断肾功能损害具有重要临床价值。

DN属中医“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴，以气阴两虚为本，瘀血阻络为标，病位在肾。患者消渴日久，化燥伤阴耗氣，终致气阴两虚;气虚则气血津液运行不畅，瘀血、痰浊阻络[11]。根据DN气阴两虚、瘀血阻络的基本病机，本研究采用中药复方糖肾煎益气养阴、活血通络辨证治疗，配方由黄芪、太子参、生地黄、山药、山茱萸、茯苓、牡丹皮、三七、五味子等配伍而成，方中黄芪、太子参、山药健脾益气，使气行血行。黄芪味甘性温，可温补肺、脾、肾，疏利三焦，可利水消肿[12]。生地黄清热凉血，养阴生津，山茱萸补益肝肾，收敛固涩。现代药理学[13]证实山地-山茱萸治疗DN具有协同增益作用，可有效抑制DN患者糖基化产物产生，抑制细胞外基质（ECM）增生和转化生长因子（TGF-β）表达，改善或延缓DN肾小球硬化。茯苓健脾渗湿、利水消肿;牡丹皮清热凉血、活血化瘀;三七止血散瘀、补虚消肿;五味子益气生津、补肾宁心。诸药配伍共奏补益脾肾，益气养阴、活血通络之功[14-15]。

本研究显示，B组大鼠的血糖、血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均明显升高，但肾功能尚正常，血清BUN、Cr升高并不显著（P>0.05），符合早期气阴两虚型2型糖尿病肾病特点。C组和D组用药治疗20周后，大鼠血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均较B组有明显降低（P<0.05或P<0.01），且2组疗效类似，证实了糖肾煎能改善2型糖尿病肾病的肾功能，对肾脏具有保护作用。但本研究也存在不足，未对糖肾煎保护2型DN大鼠肾功能的作用机制进行探究，有报道[16]指出糖克肾煎剂可能通过降低TGF-β1、mi R-192、Col1a2、Collagen I的表达，提高SIP1表达等途径保护DN大鼠肾脏功能，在后续研究有待深入完善。

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