任雪雯 李元文 胡博

摘要 目的：通过网络药理学方法探讨加味过敏煎治疗荨麻疹的作用机制。方法：检索中药系统药理学平台（TCMSP）选取加味过敏煎君药中的有效元素和作用靶点;通过检索人类基因信息数据库选取荨麻疹的疾病靶点;应用R语言筛选药物与疾病共同靶点，应用Cytoscape软件构建药物-化合物-作用靶点-疾病互作网络;运用STRING平台构建蛋白质间相互作用网络（PPI），并将结果进行可视化展示;使用Bioconductor生物信息软件包进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。结果：包含了45个化合物和相应靶点409个，并得到61个疾病相关作用靶点。富集分析得到84个GO功能条目和126条KEGG信号通路。结论：加味过敏煎作用于荨麻疹的PPI网络中IL-6、AKT1、VEGFA等靶点起着关键作用，这些靶点主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子及受体配体活性等生物学过程，并主要富集在AGE-RAGE、PI3K/Akt等多条信号通路上，发挥抗炎和免疫调节等作用，这可能是加味过敏煎治疗荨麻疹的关键作用机制。

关键词 网络药理学;加味过敏煎;荨麻疹;靶点;信号通路

Abstract Objective：To explore the mechanism of modified allergic Decoction in the treatment of urticaria based on network pharmacology theory. Methods：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） was used to select the effective constituents and action targets of Jiawei allergic Decoction. Human gene information database was used to select the disease targets of urticaria. R language software was used to screen the common targets of drugs and diseases， Cytoscape software was used to build drug-ingredient-action target-disease interaction network. Protein protein interaction network（PPI） was constructed by using the STRING platform， and the results were visualized. Bioconductor bioinformatics software package was used to perform Gene Ontology （GO） function enrichment and Kyoto pathway analysis. Results：A total of 45 compounds and 409 corresponding targets were included， and 61 disease-related targets were obtained. Enrichment analysis yielded 84 GO function entries and 126 KEGG signal pathways. Conclusion：Jiawei allergic Decoction plays a key role in IL-6， AKT1， VEGFA and other targets in the PPI network of urticaria. These targets mainly involve the biological processes of cytokine receptor binding， cytokine and receptor ligand activity， etc. It is mainly enriched in multiple signal pathways such as AGE-RAGE， PI3K/Akt， and exerts anti-inflammatory and immunomodulatory effects. This may be the key mechanism of Jiawei allergic Decoction in the treatment of urticaria.

Keywords Network pharmacology; Jawei allergic Decoction; Urticaria; Targets; Signaling pathway

中圖分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.002

荨麻疹是由肥大细胞介导的一种局限性的水肿反应，具体病理表现为皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加。临床表现可见基本皮损为鲜红色或苍白色风团，大小不等，发无定处，能相互融合，一般24 h内即可消褪，消褪后不留痕迹，急性荨麻疹病程短，超过6周则为慢性荨麻疹，且反复发作，甚者可长达数十年。急性荨麻疹具有较为明确的病因，如食物、药物或病毒感染等。而慢性荨麻疹的病因往往难以确定，目前认为慢性荨麻疹的发病与肥大细胞脱颗粒释放组胺、炎性反应递质白三烯等，进而引发后续的炎性反应、Th1/Th2细胞亚群失衡等有关[1]。据调查，高达20%的人在其一生中会出现急性荨麻疹[2]，而慢性荨麻疹的患病率约为0.05%～3%[2]。大概50%的慢性荨麻疹患者在1年内自行消退，80%会在5年内消退[3]。西医治疗以抗组胺药为首选，糖皮质激素辅助控制症状[4]，虽然有一定疗效，但不适用于儿童、老人、孕妇等特殊人群，并且应用抗组胺药导致的嗜睡及应用糖皮质激素后的不良反应严重影响了患者的正常工作。因此，深入研究荨麻疹发病的可能机制并寻找更为安全有效的干预手段对于治疗荨麻疹具有重大意义。

近年，中医药作为一种较为安全有效的治疗手段，在荨麻疹中的治疗作用中得到广泛认可。李元文教授尝试从调理肝脾功能入手治疗荨麻疹，并拟出加味过敏煎，以疏肝健脾，养血熄风为大法，标本兼治，在临床应用中疗效显著[5-6]。加味过敏煎是从祝湛予先生的经验方——过敏煎（银柴胡、乌梅、防风、五味子、甘草）加减化裁而来，原方祛风清热，敛汗固表，主要用于治疗过敏性疾病。李元文教授在此方的基础上，加入了疏肝理脾，养血通络之品，使加味过敏煎成为以疏肝健脾，养血熄风功效为主的治疗慢性荨麻疹的良方。具体方药为柴胡10 g、乌梅10 g、防风10 g、白术10 g、茯苓20 g、当归10 g、赤芍10 g、徐长卿15 g、丝瓜络10 g、鸡血藤15 g。方中柴胡、乌梅疏肝敛阴，白术、茯苓健脾化湿，共为君药，是调和肝脾治疗荨麻疹思想的核心体现。前期团队研究结果证实了，加味过敏煎对慢性荨麻疹的治疗有明显疗效[5-6]，但是作为其起效的确切效应有待进一步明确。网络药理学的研究方法是通过构建疾病-表型-靶蛋白-药物的互作关系网络，并通过GO和KEGG富集分析实现预测药物有效成分在疾病效应靶点中的可能作用机制[7]，在近几年作为研究中医药干预疾病机制的方法得到了广泛应用。因此笔者选取加味过敏煎的君药，也是疏肝健脾法的核心药对——“柴胡-乌梅”和“茯苓-白术”进行网络药理学研究，以期在分子层面上能够初步揭示加味过敏煎中运用疏肝健脾法治疗荨麻疹的可能作用机制，为本病的实验研究及临床实践提供更多的思路。

1 材料与方法

1.1 加味过敏煎君药的主要活性化合物的筛选及作用靶点的确定 本研究通过中药系统药理学分析平台——TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[8]檢索加味过敏煎君药药对“柴胡-乌梅”“茯苓-白术”的所有活性成分。根据文献方法[9-11]，通过设定口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18为限制条件筛选化合物，得到加味过敏煎君药药对的生物活性成分。并运用TCMSP数据库查询出主要生物活性成分的作用靶点，并利用Uniprot[12]数据库（https：//uniprot.org/）得到活性化合物对应关键靶点的基因号及标准化命名。

1.2 荨麻疹的疾病靶点收集 依托人类基因信息数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/）和人类孟德尔遗传研究平台OMIM（https：//www.omim.org/）进行检索关键词“urticaria”，进而得到荨麻疹的最终疾病靶点。

1.3 药物与疾病共同靶点筛选及互作网络构建 将加味过敏煎中的君药药物靶点合并后，输入疾病靶点，走脚本绘制Venn图，从而得到药物与疾病共同作用靶点交集;将得到的共同作用靶点通过STRING平台（https：//string-db.org/）[13]构建靶标蛋白互作PPI网络，并可视化处理。

1.4 药物-化合物-作用靶点-疾病作用网络图搭建通过运行Cytoscape 3.7.2软件（http：//www.cytoscape.org/）搭建药物-活性化合物-作用靶点-疾病作用网络。网络图中的节点分别代表了药物、活性成分、基因靶点和疾病，连线代表上述节点之间的相互联系[14]，更好地体现出药物中的活性成分作用于基因靶点上治疗疾病的概念。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析 将核心靶点基因进行功能富集和主要作用通路分析，使用Bioconductor生物信息软件包（http：//www.bioconductor.org/）进行GO功能富集（Gene Ontology）[15]和KEGG通路富集（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[16]分析，并对富集分析得出的结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 加味过敏煎君药的主要活性化合物及作用靶点

本研究通过TCMSP数据库，检索加味过敏煎中的君药活性成分，共收集得478个活性成分，其中柴胡有349个，乌梅有40个，茯苓有34个，白术有55个。以OB≥30%和DL≥0.18为限制条件，经筛重后共得到45个有效生物活性成分。利用数据库查询主要活性成分调控的靶点信息，共筛选出对应的作用靶点409个。最后通过Uniprot数据库对靶点和基因信息进行标准化命名。

2.2 荨麻疹的疾病靶点筛选

分别在GeneCards、OMIM数据库中检索到977个、3个荨麻疹的潜在靶点，去重后，共得到978个荨麻疹相关疾病靶点。

2.3 共同靶点筛选及互作网络构建

绘制Veen图。见图1。并得到药物主要活性成分调控的靶点与疾病靶点取交集，得到61个共同作用靶点。见表1。将这61个基因在STRING平台进行PPI网络分析，并可视化处理。见图2。得到61个节点和727条边，每个节点代表由单个蛋白质编码基因产生的所有蛋白质，每条边代表蛋白质与蛋白质的结合，即蛋白质的协同作用。统计出现较多的30个节点并绘制出图形。见图3。可以发现蛋白互作频次较高的是RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管内皮生长因子（VEGFA）、白细胞介素-6（IL6）等，他们是整个网络的节点蛋白，说明加味过敏煎疏肝健脾的中药成分与其有较高的结合活性，可作为加味过敏煎治疗荨麻疹的潜在靶点。研究表明，慢性荨麻疹患者血清IL-4、IL-6、IL-8、IL-10及IFN-γ水平异常[17]，在一定程度上支持了本项研究的结果。

2.4 药物-化合物-作用靶点-疾病网络

分别搭建出4味药物-化合物-作用靶点-疾病网络图。见图4。网络共77个节点（靶点61个，活性成分11个，疾病1个和药物4个）和200条线条，红色节点代表荨麻疹疾病，浅蓝色节点分别代表加味过敏煎4味君药，墨绿色节点代表加味过敏煎君药对应的主要活性成分，橙色节点代表基因靶点，每条线表示活性成分和基因靶点之间的相互作用关系。结果显示，槲皮素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇、常春藤皂苷元、乙酸亚油酸酯、花生四烯酸甲酯等化合物在整个网络中发挥着关键作用，可能是加味过敏煎治疗荨麻疹的核心化合物。

2.5 靶点通路分析

通过Bioconductor数据库进行GO功能分析，得到84个生物过程条目，将排名靠前的20个GO条目绘制柱状图。见图5a。可以发现，在细胞因子受体结合（Cytokine Receptor Binding）、细胞因子活性（Cytokine Activity）、受体配体活性（Receptor Ligand Activity）等生物过程中，靶点较集中。这提示加味过敏煎中疏肝健脾的活性化合物通过调控多种生物学途径对荨麻疹产生影响。

KEGG通路富集分析筛选出126条信号通路，选取P值最小的20条通路绘制柱状图。见5b。可以发现这些基因数目主要富集在糖尿病并發症AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路，等通路上。见图6。

3 讨论

本研究通过网络药理学方法构建加味过敏煎君药的“药物-活性成分-靶点-疾病”网络，共得到45个活性化合物，61个潜在靶点，126条信号通路。在活性化合物中，槲皮素和山柰酚综合评分远高于其他化合物，均存在于在柴胡、乌梅中。研究发现二氢槲皮素具有抗炎、抗过敏、止痒作用，可能是与其可以阻滞肥大细胞的Ca2+通道，通过减少Ca2+的内流而抑制肥大细胞释放组胺，从而降低毛细血管通透性，起到抗过敏止痒的效果[18]。山柰酚可调节信号传导与转录激活因子3（STAT3）和NF-κB信号通路的激活，以减弱IL-6对环氧合酶COX-2（PTGS2）表达的影响[19]，抑制处于致敏状态的肥大细胞的炎性反应，其对调节急性和慢性炎性反应起关键作用。豆甾醇能降低炎性反应因子IL-1β、IL-6、MCP-1和COX-2的mRNA表达，起到抗炎及免疫调节的作用[20]。β-谷甾醇、常春藤皂苷元亦具有抗菌抗炎等方面作用[20-21]。

将加味过敏煎主要活性成分调控的靶点与荨麻疹的靶点取交集，得到61个关键靶点，大致分为细胞因子、蛋白激酶和其他蛋白酶3类。其中细胞因子占绝大部分，有IL-6、IL-1B、IL-10、IL-2、VEGFA、EGF、CXCL8、CCL2、IFNG、TNF、ICAM1、VCAM1、STAT1、CD40LG等。蛋白激酶有AKT1、ERBB2等。其他如PTGS2、HMOX1、caspase-3、CRP等。IL-6被证明是一种内源性热原，能够在自身免疫性疾病或感染患者中引起发热。这种蛋白质主要在急性和慢性炎性反应部位产生，在该部位分泌到血清中，并通过IL-6Rα诱导转录炎性反应。研究表明，在慢性自发性荨麻疹患者中，IL-6、sIL-6R和血清CRP的浓度显着升高[22]。IL-6可以以STAT3依赖性方式增强FcεRI诱导的COX-2表达、PGD2生物合成和VEGF的产生，并通过促进组织内肥大细胞产生炎性PGD2而参与人类过敏性疾病[23]。IL-6还可以通过抑制sIL-6R从IL-6R的蛋白水解切割并下调SOCS3自抑制途径，从而促进肥大细胞（MC）增殖并形成更具反应性的表型[24]。荨麻疹发生的中心环节是肥大细胞活化脱颗粒，故而猜测加味过敏煎可能通过抑制IL-6水平表达，改善荨麻疹患者的MC相关症状和病理，进而治疗患者的症状体征。VEGFA基因是PDGF/VEGF生长因子家族的成员，可以调节细胞的增殖和凋亡，还可以诱导血管通透性，对于生理和病理性血管生成都是必不可少的[25]。有研究表明，VEGFA诱导血管内皮细胞的增殖或存活主要是通过ERK、PI3K/Akt通路形成的，这些通路的激活受这些信号蛋白调控[26]。其中AKT激活可以调控内皮细胞的存活、增殖、增加血管通透性，同时也表现出一定的炎性内皮细胞的特点[27]。同时研究表明，AKT1基因的缺失可以导致血管内皮生长因子诱导的血管生成，从而增加伤口、炎性反应和血管通透性[28]。荨麻疹是由于血管通透性的短暂增加，而引起皮肤或黏膜的急性肿胀，从而发生时隐时现的红白风团。这61个关键靶点，大多涉及炎性反应、免疫调节和血管通透性方面，推测可能是加味过敏煎中疏肝健脾法治疗荨麻疹的关键作用。

富集分析共得到84个GO功能条目和126条KEGG通路。其中，GO功能分析主要涉及炎性反应、氧化与抗氧化活性、免疫应答、细胞增殖和凋亡等作用，并且在炎性反应因子中体现了高度的结合活性，可作为中药治疗荨麻疹的关键作用。KEGG通路富集分析显示，在靶点富集的前20条通路中，基因数目主要富集在糖尿病并发症PI3K/Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路和TNF信号通路等通路上。其中在PI3K/Akt信号通路中，当酪氨酸激酶（RTK）和G蛋白连接受体结合，激活下游具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体连接蛋白从而激活PI3K，并激活底物磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）向磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）转化。PIP3结合Akt以及磷酸肌醇依赖激酶1（PDK1）后，Akt构象变化，同时Akt迁至细胞膜，磷酸化膜上的PDK21和PDK2蛋白，进一步活化Akt[29]，促进激活下游蛋白，如核转录因子-κB（NF-κB）、叉头转录因子（FoxO）等，通过复杂的信号传递网络，PI3K/Akt信号通路参与免疫调控[30]、介导细胞因子表达[31]、调节凋亡[32]。

荨麻疹在中医又称“瘾疹”“风疙瘩”“赤白游风”等。现今社会，随着生活节奏的加快，普遍存在工作、学习压力大的情况，再加上饮食不规律，嗜食肥甘厚味，极易损及肝、脾。古人对肝脾失调导致荨麻疹也有所阐述，如“瘾疹……有人一生不可食鸡肉及章鱼动风之物，才食则丹随发，以此得见系是脾风”[33];“以饮食久膊、膏粱厚味、醇酒辛辣之物，日久太过……其风块多出于胸部、或见于四肢”[34];另肝失疏泄也可引发荨麻疹，如《外科枢要》言：“赤白游风属……或肝火风热、血热”。盖情志不遂，郁怒伤肝，肝逆克脾土。肝失调达而横乘脾土，加之饮食、劳倦伤脾，脾失健运而反侮于肝;又因肝藏血，脾统血，肝失疏泄，运化血，脾虚化源不足，导致血虚生内风，或脾湿日久郁而化热，热灼肝经，伤津耗液，热极生风，发于肌表而见皮疹。现代医家对于中医之肝、脾的功能、生理特点的表述，与现代医学脏器功能认识大多一致。肝脏具有解毒、造血和凝血作用，脾脏内的大量巨噬细胞可以清除衰老的血细胞、抗原和异物、激发免疫反应。肝气郁滞，其解毒功能受损;脾气虚弱，其免疫反应失调。因此，李元文教授在此基础上提出：荨麻疹的发病与肝脾功能失调有密切的关系[35]。李教授认为荨麻疹的发病与外毒侵袭密不可分，生活中的过敏原或毒性物质，如重金属、药物、食物添加剂、食物里面的某些成分，经过口服、呼吸道和皮肤吸收进入人体，其中部分小分子无法像病毒细菌那样引起免疫反应，便可以依靠肝脏的解毒功能来治疗。结合本研究网络药理学结果，加味过敏煎中疏肝健脾法治疗荨麻疹的作用可能与其活性化合物发挥抗炎、免疫调节等机制相关。

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（2020-04-15收稿 责任编辑：徐颖）