古丽娜·巴德尔汗，李远春，阿依努尔·莫合买提，王 乐，刘年强△

1.新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心结核病/麻风病防治中心，新疆乌鲁木齐 830002；2.北京医院呼吸与危重症学科，北京 100730

结核病是造成人类死亡最多的慢性呼吸道传染病，我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病负担位居全球第2位[1]。新疆维吾尔自治区是全国结核病疫情较为严重的地区，结核病感染率高，经济欠发达，加之交通不便，严重制约着对结核病的防治，另外，随着新疆维吾尔自治区耐药结核病患者的增多，结核病防治工作更为艰巨。目前，新疆维吾尔自治区结核分枝杆菌耐药性检测主要应用比例法药敏试验，但该方法对实验室操作环境及实验人员技术水平要求较高，并且获得药敏结果的时间较长，不能及时对临床进行用药指导。随着分子生物学技术的快速发展，越来越多的分子诊断技术应用于结核分枝杆菌耐药性检测，DNA-微阵列芯片检测技术(以下简称基因芯片技术)和利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Gene-Xpert MTB/RIF技术)是其中2种方法，这2种技术较传统培养法能够在短时间内较为准确地鉴定结核分枝杆菌并检测其耐药性，可以较早、较准确地指导结核病患者的临床用药。

本研究选择2015年新疆维吾尔自治区耐药监测菌株，经转录间隔序列菌种鉴定后，以比例法药敏试验结果为耐药检测“金标准”，评价基因芯片技术及Gene-Xpert MTB/RIF 技术对结核分枝杆菌菌种鉴定和耐药性诊断的效能，为后期在新疆维吾尔自治区全面开展分子诊断技术提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 选取2015年新疆维吾尔自治区耐药监测的120例疑似结核分枝杆菌感染者的临床分离株，菌株按各地区上交菌株比例随机纳入，其中喀什地区31株，和田地区23株，伊犁地区19株，克州地区17株，阿克苏地区12株，阿勒泰地区10株，乌鲁木齐市4株，吐鲁番和克拉玛依市各2株。经16～23 S rDNA转录间隔序列测序鉴定其中115株为结核病患者菌株，5株为非结核病患者菌株，故本研究最终纳入分析的为115株结核分枝杆菌临床分离株。所有菌株均有异烟肼和利福平的表型药敏试验结果，基因芯片技术和Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结果也均为阳性。在115例结核病患者中，男56例(48.70%)，女59例(51.30%)；年龄19～84岁，平均(54.32±16.28)岁；初治65例(56.52%)，复治50例(43.48%)。

1.2罗氏固体培养基比例法药敏试验 改良罗氏培养基、利福平和异烟肼含药改良罗氏培养基均为自制。用于比例法药敏试验的利福平和异烟肼含药培养基药物终浓度分别为40.0 μg/mL和0．2 μg/mL。首先将菌悬液配制成1 mg/mL，再稀释成10-2、10-4mg/mL 2个浓度，分别接种于利福平和异烟肼含药改良罗氏培养基上。所有操作均按照中国防痨协会基础专业委员会制订的《结核病诊断实验室检验规程》[2]进行。本试验使用的利福平和异烟肼均为美国Sigma公司产品(批号分别为080M1506V和060M0090) 。质控菌株为结核分枝杆菌标准菌株H37RV，来自中国疾病预防控中心结核病预防控制中心国家结核病参比实验室。

1.316～23 S rDNA转录间隔序列测序 用10.0 μL接种环刮取罗氏固体培养基上生长的菌株约1/2环，水煮法提取DNA，-20 ℃保存备用。将分枝杆菌核酸1.0 μL，引物1为1.0 μL，引物2为1.0 μL，2×MIX 12.5 μL混合配制成28.0 μL的反应体系。将上述混合物于94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，63 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。测序上游引物：5′-GAA GTC GTA ACA AGG TAG CCG；下游引物：5′-GAT GCT CGC AAC CAC TAT CYA[3]，分别位于上游16 S rDNA的末端和16～23 S rDNA 转录间隔序列保守区。引物的合成及扩增产物的纯化和测序均由北京擎科生物有限公司完成。

1.4基因芯片技术检测 取出PCR扩增试剂，自然解冻后摇匀，分装反应体系，分别介入2.0 μL标本核酸溶液，按照耐药PCR扩增程序进行检测。进行芯片杂交及洗涤，运行结核耐药芯片杂交程序，条件50 ℃杂交2 h，转速5 r/min，预热芯片洗干仪，待显示“请放入芯片进行洗涤”对话框，放入杂交芯片，按照提示操作，确认甩干。开始扫描，由系统判读结果。基因芯片检测系统及配套试剂均由北京博奥生物有限公司生产。

1.5Gene-Xpert MTB/RIF技术检测 首先吸取保存菌液约1 mL放入15 mL的一次性无菌离心管中,再加入前处理液2 mL,拧紧盖子用涡旋振荡器振荡30 s左右后,室温静置15 min,用无菌吸管吸取2 mL，由加样孔缓慢加入试剂盒内,盖紧试剂盒盖后上机测试,由仪器自动判读结果。Gene-Xpert MTB/RIF试剂盒为美国 Cepheid 公司产品。

2 结 果

2.1基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性 比例法药敏试验检出利福平耐药患者40例(34.78%)，基因芯片技术检出利福平耐药40例(34.78%)。以比例法药敏试验结果为“金标准”，基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性诊断的灵敏度、特异度分别为80.00%、89.33%,阳性预测值、阴性预测值分别为80.00%、89.33%,准确度为86.87%,kappa值为0.693。将患者分为初治、复治2组分别分析，发现基因芯片技术检测复治患者对利福平耐药性的灵敏度和阳性预测值较高。基因芯片技术与比例法药敏试验检测结核分枝杆菌对利福平耐药性具有中度一致性，见表1。40例利福平耐药标本中利福平rpoB基因耐药位点分布为531(TCG→TTG)位点24例(60.0%)，526(CAC→TAC)位点3例(7.5%)，526(CAC→GAC)位点3例(7.5%)，511(CTG→CCG)位点5例(12.5%)，516(GAC→GTC)位点4例(10.0%)，513(CAA→AAA)位点1例(2.5%)。

表1 基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的诊断效能评价

表2 基因芯片技术检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的诊断效能评价

2.2基因芯片技术检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性 比例法药敏试验检出异烟肼耐药48例(41.74%)，基因芯片技术检出异烟肼耐药39例(33.91%)。以比例法药敏试验结果为“金标准”，基因芯片技术检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药性诊断的灵敏度、特异度分别为77.08%、97.01%，阳性预测值、阴性预测值分别为94.87%、85.53%，准确度为88.70%，Kappa值为0.761，基因芯片技术和比例法药敏试验检测结核分枝杆菌对异烟肼耐药性有较高的一致性，见表2。39例异烟肼耐药标本中异烟肼katG基因耐药位点分布为315(AGC→ACC)位点31例(79.5%)，315(AGC→AAC)位点5例(12.8%)；异烟肼A基因耐药位点分布为-15(C→T)位点2例(5.1%)，katG基因315(AGC→ACC)位点联合异烟肼A基因-15(C→T)位点突变1例(2.6%)。

2.3Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性 比例法药敏试验检出利福平耐药40例(34.78%)，Gene-Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药41例(35.65%)例。以比例法药敏试验结果为“金标准”，Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性诊断的灵敏度、特异度分别为92.50%、94.67%，阳性预测值、阴性预测值分别为90.24%、95.95%，准确度为93.91%，kappa值为0.867。Gene-Xpert MTB/RIF技术与比例法药敏试验检测结核分枝杆菌对利福平的耐药情况有较高的一致性。将患者分为初治、复治2组分别分析，发现Gene-Xpert MTB/RIF技术检测复治患者对利福平耐药性的灵敏度和阳性预测值较高。见表3。

表3 Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的诊断效能评价

2.4基因芯片技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的诊断效能评价 115例基因芯片技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术检验结果均为阳性的患者中，基因芯片技术检出利福平耐药40例(34.78%)，Gene-Xpert MTB/RIF技术检出利福平耐药41例(35.65%)例。基因芯片技术和Gene-Xpert MTB/RIF技术对利福平耐药患者的诊断效能比较见图1。检验结果显示,2种分子生物学检测方法对利福平耐药患者的诊断效能差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 基因芯片技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的诊断效能比较

2.5ROC曲线分析 以比例法药敏试验结果为参照标准，绘制基因芯片技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的ROC曲线。基因芯片技术ROC曲线下面积为0.850±0.040，Gene-Xpert MTB/RIF技术ROC曲线下面积为0.936±0.020，Gene-Xpert MTB/RIF技术ROC曲线下面积大于基因芯片技术，2种方法曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 基因芯片技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的ROC曲线

3 讨 论

我国是全球27个耐多药结核病高负担国家之一。利福平与异烟肼作为最重要的一线抗结核药物组合，快速检测结核分枝杆菌对利福平与异烟肼的灵敏度对指导临床治疗用药具有重要意义。近年来，随着分子生物学理论与技术的不断发展，一些分子生物学诊断技术也逐渐用于临床结核病的诊断和指导治疗。Gene-Xpert MTB/RIF技术和基因芯片技术均为WHO批准并推荐用于肺结核诊治的分子生物学诊断技术[4]。

基因芯片技术通过检测标本中结核分枝杆菌的rpoB、katG和异烟肼A基因的突变情况，判定其对利福平和异烟肼的耐药性，具有快速、简便、高通量等特点，一次能够同时检测十几至几十个基因位点，适用于多位点分析，其灵敏度、特异度及准确度已得到临床广泛认可[5-7]。本研究中，基因芯片技术对利福平耐药检测的灵敏度为80.00%，特异度为89.33%，准确度为86.87%，对异烟肼耐药检测的灵敏度为77.08%，特异度为97.01%，准确度为88.70%，具有较高灵敏度及准确度，其结果与比例法药敏试验具有中度一致性，与目前报道的研究结果基本一致[8-9]。

Gene-Xpert MTB/RIF技术是集标本处理、DNA提取、核酸扩增、结核分枝杆菌特异核酸检测、利福平耐药基因rpoB突变检测于一体的结核病和耐药结核病快速诊断方法，是WHO推荐的结核分子生物学检测技术之一，全过程只需约2 h，耗时短，操作简单，无生物安全需求[5]。本研究中，Gene-Xpert MTB/RIF技术对利福平耐药检测的灵敏度、特异度分别为92.50%、94.67%。以往研究表明，Gene-Xpert MTB/RIF技术诊断利福平耐药的灵敏度为92.9%～98.2%，特异度为95.5%～98.7%[6-7]，与本研究结果基本一致。

利福平发挥抑菌和杀菌作用的机制为作用于结核分枝杆菌DNA依赖的RNA聚合酶的β亚单位，干扰转录的开始及RNA的延伸。95.0%对利福平耐药菌株的突变发生在rpoB 基因81 bp的热点区域(编码密码子为507～533位)， 该区域被称为利福平耐药决定区，85.0%耐药菌株出现531位Ser、526位His和516位Asp基因变异[10]。本研究采用结核分枝杆菌耐药试剂盒检测rpoB基因利福平耐药决定区的531、526、511、516、513位密码子，结果显示，新疆维吾尔自治区531突变位点为优势突变位点，其中531位点占60.0%，526位点占7.5%，与相关研究结果相似[11-12]。

异烟肼主要作用于细胞壁中的分枝菌酸、DNA、脂类等成分。在耐异烟肼的结核分枝杆菌分离株中有50%～90%的katG基因发生突变，另一个与耐药性密切相关的基因为异烟肼A基因，该基因突变致结核分枝杆菌异烟肼耐药比例为3%～30%[13]。本研究采用结核分枝杆菌耐药试剂盒检测katG基因的315位密码子和异烟肼A基因的-15 位密码子，结果显示，新疆维吾尔自治区katG基因突变占主导地位(92.3%)，占绝对优势，异烟肼A基因突变占次要地位(5.1%)。katG基因315位点为绝对优势突变位点(92.3%)，与相关研究结果不一致[12-14]，可能的原因为本研究是以比例法药敏试验为“金标准”，而其他研究多采用Bactec MGIT960液体培养法或DNA测序为判断标准，除此之外，基因突变位点也存在地域性差异，以往研究结果显示，不同地区结核分枝杆菌耐异烟肼相关基因的突变类型和比例不同，因此，其耐多药结核病快速诊断试剂盒的检测结果不同[10]。

本研究中，基因芯片技术和Gene-Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药检测的灵敏度和特异度均高于异烟肼。基因芯片技术、Gene-Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药的工作原理均为测定结核分枝杆菌的rpoB基因突变。有文献报道，利福平耐药结核分枝杆菌的rpoB基因突变率为95.0%[15]，异烟肼耐药的结核分枝杆菌分离株其katG和异烟肼A基因操纵子的突变比例只占80.0%，小于rpoB基因在利福平耐药中的比例；KatG与异烟肼A基因中除本研究选择的315及-15位点外，极少数其他位点突变也可能引起异烟肼耐药[16]。此外，陆续发现新的异烟肼耐药相关基因，如ahpC，但基因芯片技术并不能检测该耐药相关基因的突变情况。故基因芯片技术和Gene-Xpert MTB/RIF技术检测方法对利福平耐药的检测效能稍高于对异烟肼的检测效能。Gene-Xpert MTB/RIF技术检测利福平耐药诊断效能稍高于基因芯片技术(ROC曲线下面积0.936vs. 0.850)，可能的原因为Gene-Xpert MTB/RIF技术是一体化操作，包括痰标本处理、DNA提取、核酸扩增、结核分枝杆菌特异核酸检测、利福平耐药基因rpoB突变检测等，与手工处理相比标准化程度更高。

新疆维吾尔自治区经济欠发达，农村地区生存条件严苛，结核病是主要的传染病之一。据2000年全国第四次结核病流行病学抽样调查结果显示，新疆维吾尔自治区结核病患病率、涂阳患病率和死亡率分别是 464/10万和160/10万和 38/10万，分别是全国平均水平的1.26、1.51和3.88 倍。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示，新疆维吾尔自治区15岁以上人群活动性肺结核患病率达1 576/10万，南疆喀什地区高达2 727/10万，其中农牧民患者占72.5%，农村居民患病率是城市的3倍[16]。新疆维吾尔自治区结核病患者发病率高，农村人口多于城市人口，分布较广，迫切需要结核耐药快速诊断方法以指导患者的治疗。

常规使用传统培养和药敏试验检测结核分枝杆菌的耐药性,通常需要8～12周的时间 ，Bactec MGIT960液体培养和药敏试验也需要2～4周的时间。基因芯片技术和Gene-Xpert MTB/RIF技术运用多重PCR扩增和反向杂交原理，通过检测结核分枝杆菌相关耐药基因的突变情况，可在2～4 h内诊断出结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性[17]。Gene-Xpert MTB/RIF技术操作简单，检测一体化程度高，对检测人员要求较低，适合在新疆维吾尔自治区广泛推广。基因芯片技术与Gene-Xpert MTB/RIF技术相比，检测的耐药范围更广。这2种分子生物学技术缩短了获取一线抗结核药物药敏结果的时间，对指导患者尤其是新疆维吾尔自治区耐多药患者的治疗有重大意义。

本研究中也有一些不足：由于成本问题，本研究入选标本数量相对不足，在耐药性评价中存在一定局限性；2种分子生物学技术所检测耐药基因位点有所不同，基因芯片技术覆盖面相对较广且清晰，而Gene-Xpert MTB/RIF技术仅能定性检测是否为利福平耐药，无法对基因芯片相关的基因突变型进行验证；本研究未评价3种耐药检测方法的效益与成本。