宋志远 聂波

【摘   要】 土壤中有效磷的缺乏已成为限制农业生产的重要因素之一，解磷菌可以将土壤中的无效磷转化为植物可吸收利用的有效磷，对提高农作物的产量至关重要。本文對高效解磷菌的筛选及应用进行了探讨研究，希望能为业界同行提供参考。

【关键词】 解磷菌;有效磷;筛选

中图分类号：Q93               文献识别码：A               文章编号：2096-1073（2020）11-0056-57

[Abstract] The lack of available phosphorus in soil has become one of the important factors limiting agricultural production. Phosphorus release bacteria can convert ineffective phosphorus in soil into available phosphorus that can be absorbed and utilized by plants， which is very important to increase crop yield. In this paper， the screening and application of high efficiency phosphorous bacteria were studied， hoping to provide reference for industry peers.

[Key words] Phosphate-resolving bacteria; available phosphorus; screening

1  引言

中国的磷矿资源储量丰富，总量为167.86亿吨，但可开发利用的储量却很小，仅占总储量的1/8左右。中国70%的磷矿开采都用于生产含磷肥料，开发利用的强度逐年增加。另外，资源的不合理使用加速了国内磷矿石资源的枯竭。长期以来，由于化学肥料的不合理使用，带来了一系列的土壤问题，导致磷的减少，可以逐年直接在土壤中使用。在中国北方，钙质土壤的总磷含量较高，而在中国南方酸性土壤中的总磷和有效磷含量非常低。大部分磷处于固定状态，难以满足作物生长发育的需要。微生物是土壤生态系统的重要组成部分。微生物的种类和数量对土壤磷的转化和有效性影响很大，其中解磷细菌的应用可以提高不溶磷的利用率，提高解磷效率[1]。

当前国内外生物有机肥主要有家禽粪便以及污水污泥构成。随着人们对于肉质产品的需求量增大，畜牧业在进行养殖的过程中通常会使用含有抗生素与激素的饲料，从而达到加快动物生长速度的目的。但是由于饲料中含有的重金属等会随着动物的排泄排出，将其作为有机肥会导致环境受到严重破坏。因此，寻求绿色环保的有机肥料是当前农业发展过程中急需解决的问题之一。中药渣作为一种重要的有机肥肥源具有价格实惠、产量大、分布广的优点，因此在我国得到了广泛的应用。解磷菌作为药渣中关键性的微生物种类，能够将难溶性磷分解为可溶性磷，从而保证作物能够很好的吸收磷元素。因此，提取出具有高效分解不溶磷能力的解磷菌对我国药渣利用率的提高具有重要意义。

2  材料

2.1  仪器

VD.650桌上式洁净工作台购自苏州净化设备有限公司;YxQ-sG46-280sA手提式压力蒸汽灭菌器购自上海博迅实业有限公司;THz-103B恒温培养摇床购自上海一恒科学仪器有限公司;UV-2100紫外可见分光光度计购自上海尤尼柯仪器有限公司;AA-7000原子吸收分光光度计购自日本岛津公司;varioELcube元素分析仪购自德国Elementar公司;旋转蒸发仪购自德国IKA公司;FD-1c-50冷冻干燥机购自北京博医康实验仪器有限公司;CR22冷冻离心机购自日本Hitachi公司。

2.2  原料

江西某中药厂室外堆放3年的药渣。

2.3  试剂

葡萄糖、蔗糖、H2SO4、K2HPO4、K2SO4、NaCl、CaCO3、MgSO4·7H2O、NaH2PO4、FeCl3·6H2O、（NH4）2SO4、KCl、FeSO4·7H2O、MnSO4.H2O、Ca3（PO4）2、无水乙醇等均为分析纯;抗坏血酸、酒石酸锑氢磷、钼酸铵、硼酸、甲基红等购自上海麦克林生化科技有限公司;琼脂粉购自广东环凯微生物科技有限公司;磷长石粉购自广州翔博生物科技有限公司;溴百里香酚蓝购自天津市天新精细化工开发中心;溴甲酚绿购自上海展云化工有限公司。利用钼蓝比色法检测发酵液中可溶性磷含量。

2.4  培养基的配制

2.4.1  Ashby无磷培养基    在450mL ddH2O中依次加入0.1g K2HPO4、2.5gCaCO3、0.5g CaSO4.2H2O、0.1g NaCl、0.1g MgSO4.7H2O、5g甘露醇，添加ddH2O使总体积达到500mL，将培养基放置在磁力加热搅拌器上充分混匀，调节培养基的pH为7.0，放入高压灭菌锅中12l℃ 20min灭菌后取出待用（固体培养基中需加入10g琼脂糖后再灭菌）。

2.4.2蒙金娜培养基（无机磷培养基）：在450mL ddH2O中依次加入5g葡萄糖、12.5g Ca3（P04）2、0.25g （NH4）2SO4、0.15g MgSO4.7H2O、0.15g NaCl、0.15g KCl、0.015g FeSO4以及0.015g MnSO4.H2O，添加ddH2O使总体积达到500mL，将培养基放置在磁力加热搅拌器上充分混匀，调节培养基的pH为7.0，放入高压灭菌锅中12l℃ 20min灭菌后取出待用（固体培养基中需加入10g琼脂糖后再灭菌）。

2.4.3  有机磷培养基    在450mL ddH2O中依次加入5g葡萄糖、0.25g （NH4）2SO4、0.15g NaCl、0.15g KCl、0.15g MgSO4.7H2O、0.015g FeSO4.7H2O、0.015g MnSO4.H2O，添加ddH2O使总体积达到500mL，将培养基放置在磁力加热搅拌器上充分混匀，调节培养基的pH为7.0，放入高压灭菌锅中12l℃ 20min灭菌后取出待用，当温度降至60℃时，在培养基中加入5mL蛋黄液（生理盐水与蛋黄液等体积混合配制）（固体培养基中需加入10g琼脂糖后再灭菌）。

2.4.4  解磷培养基    在450mL ddH2O中依次加入0.0025g FeCl3、0.25g MgSO4.7H2O、0.05g CaCO3、0.25g蔗糖、0.05g溴百里香酚蓝以及使用ddH2O清洗5次后的0.5g磷长石粉，添加ddH2O使总体积达到500mL，将培养基放置在磁力加热搅拌器上充分混匀，调节培养基的pH为7.0，放入高压灭菌锅中12l℃ 20min灭菌后取出待用（固体培养基中需加入10g琼脂糖后再灭菌）。

3  方法

3.1  解磷菌筛选

3.1.1  分离解磷菌    在20mL的ddH2O水中加入10g药渣，放置于摇床中混合5min。取出混匀的液体后，使用移液枪分别将混合液稀释为1×10-1、1×10-6，从每个梯度的混合液分别中吸取200uL液体至Ashby无磷固体培养基中，用灭过菌的涂布棒将培养基上的混合液涂抹均匀，晾干后于28℃培养箱中倒置培养2天。从生长好的Ashby无磷固体培养基中挑选长势良好的单菌落，通过平板划线法对选取的单菌落进行分离纯化，将最终得到的单菌株移至斜面，放入4℃冰箱中保存备用。

3.1.2  固磷能力测定    将3.1.1中得到的解磷菌使用灭菌后的接种环移至Ashby无磷固体培养基中，放置在28℃培养箱中复苏3天。从培养基上选取长势良好的单菌落移至100mL无磷液体培养基中，放置于28℃摇床中以180rpm生长3天得到种子液。将生长好的菌液于离心机中6000rpm离心10min，将得到的菌液沉淀取一部分干燥至粉末后称重，并以中药菌体.1的方式对其进行命名。将剩余菌液沉淀分为3份，分别移至250mL532的Ashby无磷液体培养基中，放入28℃摇床中180rpm生长7天。取出培养好的菌液，放入离心机中离心处理，上清液旋蒸后冷冻干燥获得粉末，对获得的粉末称重后以中药发酵液-1的方式命名;离心得到的沉淀放入50℃烘箱中干燥处理后进行称重，得到的粉末以中药菌体-2的方式命名。利用元素分析仪对得到的三份粉末中磷的比例进行检测。

3.2  解磷菌筛选二

3.2.1  解磷菌分离    菌悬液按照3.1.1中的方式获得，并稀释为1x10-1、1×10-6，从每个梯度的混合液分别中吸取200uL液体至有机磷固体培养基中，用灭过菌的涂布棒将培养基上的混合液涂抹均匀，晾干后于30℃培养箱中倒置培养2天。取出培养基后，选择菌体周围有溶磷圈的单菌落，用灭菌后的接种环移至蒙金娜固体培养基上培养，随后选择菌体周围有溶磷圈的单菌落进行划线分离，最终选取长势良好的单菌落移至菌体保藏培养基上，置于4℃冰箱保存备用。

3.2.2  解磷能力测定    将3.2.1中得到的解磷菌用灭菌后的接种环移至活化培养基上，随后从生长好的培养基上各选择一环解磷菌移至液体种子培养基，放入摇床中培养。分别吸取2mL生长好的菌悬液移至蒙金娜液体培养基中，在液体培养基中加入2mL ddH2O当作对照组，放入30℃摇床中180rpm生长7天。利用钼蓝比色法对溶性磷的含量进行检测。依次量取2mL各个菌悬液移至解磷培养基中，在液体培养基中加入2mL ddH2O当作对照组，放入30℃摇床中180rpm生长7天，利用分光光度法对菌体的解磷能力进行测定。

4  高效解磷菌的应用

4.1  基肥增施20kg/亩高效解磷菌肥的施肥方式在确保产量、实现增产的方面具有优秀的表现

基肥增施15kg/亩高效解磷菌、基肥减量20%，增施高效解磷菌肥40kg/亩、基肥增施20kg/亩高效解磷菌的施肥方式三种施肥方式相对于常规施肥分别实现了亩增产32.4kg/亩、38kg/亩、102.1kg/亩，增产率分别为4.6%、5.5%、14.6%。由经济效益而言，采用基肥减量20%，增施高效解磷菌肥40kg/亩的施肥方式，可以有效降低肥料投入成本，提高农民收入。

4.2  药渣中含有多种养分物质，包括纤维、多糖、蛋白质以及微量元素等

由于药渣的透气性良好，因此可用于园林植物与农作物生长的堆肥原料。在中成药的生产、中药材加工以及原料药的生产过程中均会产生药渣，其中在中成药的制造过程中药渣的产量最高，能够达到总药渣量的七成。当前我国制药企业主要通过焚烧、填埋以及堆放的形式进行药渣的处置。这些处置方式不但会浪费大量的药渣资源，而且会对生态环境造成严重的破坏，因此如何科学合理的提高药渣利用率是当前制药企业的核心工作之一。

4.3  在油菜的盆栽试验中，郝静和其他研究表明，解决磷酸盐问题的不同细菌可以使农作物的地上鲜重增加7.0%至44.4%

在邢方芳等人的研究中，应用分解磷酸盐的细菌后，蝴蝶兰的鲜重增加了32.94%。何国强等人的研究表明，接种可分解磷酸盐的复合细菌可以提高小麦根际土壤的细菌多样性指数和丰富度指数。方华洲等的研究表明，用复合杀真菌剂处理水稻土可使土壤有效磷含量提高32.17%。何国强等的研究表明，分解磷酸盐的复合细菌可以使小麦的最大产量提高14.49%。相反，在本研究中施用復合接种物后，油菜鲜重增加了57.77%，显示出非常好的施用效果。

参考文献：

[1] 柯春亮，李淑娟，段雅婕.解磷菌株M-3-01发酵工艺优化[J].河南科技学院学报 （自然科学版），2017，45（03）：6-15.

[2] 宁清，刘迪，靳翔，等. 磷矿区高效解磷菌的分离鉴定及其碱性磷酸酶的克隆表达[J].山西农业科学，2019，47（11）：1974-1979.

[3] 苑伟伟，赵阳国，井永苹，等.一种高效解磷复合菌剂的筛选与应用[J].山东农业科学，2016，48（12）：86-90.

[4] 薛应钰，叶巍，杨树， 等.一株溶磷菌的分离鉴定及溶磷促生作用[J].干旱地区农业研究，2019，37（4）：253-262.

（编辑：赫亮）