李 菁, 张小飞, 谭清峰, 杨雨欣

(1.西安文理学院 生物与环境工程学院，陕西 西安 710065;2.西安市农业技术推广中心，陕西 西安 710061)

玉米灰斑病是由尾孢菌Cercospora侵染引起的一种世界性病害，该病于1924年在美国伊利诺伊州首次被发现[1]，随后逐步蔓延至世界主要玉米种植区[2,3]。我国于1991年首次报道了该病的发生[4]，至今在辽宁、吉林和黑龙江东北春玉米区和西南地区普遍发生，在陕西发生呈现快速上升趋势[5]。值得注意的是，在西南地区和陕西等地发生的玉米灰斑病病原为玉米尾孢(Cercosporazeina)，与我国北方地区玉米灰斑病病原玉蜀黍尾孢(Cercosporazeae-maydis)分属于不同的种[6～9]。研究者认为玉米灰斑病属数量性状遗传，同时受基因加性、显性和上位性效应控制[10～12]；由于两种病原菌的致病力不同，所以对C. zeae-maydis侵染的灰斑病抗性遗传研究并不能完全反映玉米灰斑病的抗病遗传规律。笔者研究利用尾孢灰病抗性差异显著的优良高抗自交系R225和高感材料掖478组配的 F2群体为作图群体，构建高密度遗传连锁图谱。采用田间诱发鉴定对F2:3群体进行多年多点抗性综合分析。利用QTL IciMapping 分子标记作图软件分析玉米尾孢菌抗性QTL，为抗病基因的精细定位提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 群体构建

根据多年的田间鉴定结果并参考农艺性状表现，选取玉米自交系R225和掖478 为作图群体的亲本。2011年冬季在海南岛以R225(高抗灰斑病的优良自交系)为父本，掖478(高感灰斑病骨干自交系)为母本进行杂交，获得F1 种子，2012年夏季将F1植株套袋自交产生F2种子，2012年冬播种F2种子，选取其中的345个F2单株作为研究群体。

1.2 表型鉴定

于2013年和2014年，在云南德宏和湖北恩施种植345个F2:3家系及其亲本，进行田间自然诱发鉴定。每50～100份鉴定材料设抗病亲本、感病亲本做对照，鉴定小区行长4 m，行距0.7 m，留苗15～20株，株距略小于大田生产，其他田间管理措施同当地生产管理，整个生育期不打杀菌剂。乳熟期记载单株发病级别。

1.3 基因组DNA提取

取少量幼嫩组织于液氮中研磨，加入CTAB裂解缓冲液(10%CTAB、5 mol·L-1NaC1、1 mol·L-1、pH 值8.0 Tris-HC1、0.5 mol·L-1EDTA、0.2%巯基乙醇)，氯仿/异戊醇(24∶)抽提两次，用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，干燥后加入1×TE缓冲液溶解DNA，用Nanodrop 2000测定浓度，统一稀释到30 ng·μL-1备用。

1.4 SSR标记的检测

SSR引物序列选自MaizeDB(http://www.maizegdb.org)，由上海生工生物工程公司合成，采用10 PCR反应体系，Taq酶(5U·μL-1)0.2 μL，10×PCR buffer 1 μL，25 mmol·L-1MgCl21μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，10 mmol·L-1SSR引物各1 μL，30 ng DNA模板，加ddH2O补足至10 μL，反应液上加盖20 μL矿物油。扩增程序为94℃预变性4 min，1个循环；94℃变性30s；65℃复性40s；72℃延伸40s，然后每个循环降低1℃，至退火温度为55℃，再循环30次；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物与2 μl上样缓冲液混合用6.0%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，记录下亲本及各家系的带型情况。

1.5 QTL作图及基因效应分析

利用QTL Icimapping 软件进行抗病QTL定位分析。打开软件，导入构建准备好的map格式图谱的数据，点击分组出现group群，完成分组后，击ordering命令，转换成染色体，点击工具栏上的map图标进行遗传连锁图谱构建。结合灰斑病抗病性表型数据进行QTL定位，采用ICIM-ADD进行QTL检测。

2 结果与分析

2.1 遗传图谱的构建

筛选了玉米各个染色体上1 000多对引物，有127对多态性明显，带型清晰，重复性好的引物。利用这些引物构建了含127个SSR标记的玉米遗传连锁图谱，图谱总长1 738 cM，图距约为13.6 cM。经x2检验，多数SSR标记符合孟德尔分离比例(1∶2∶1)，个别 SSR标记表现偏分离。玉米染色体多态性标记介于8～20个，平均13个，其中1号和4号染色体多态性引物最多，为20个，9号染色体最少为8个，引物在染色体的顺序与IBM2 2008 Neighbors Frame6上的位置一致。

2.2 表型鉴定

在云南德宏和湖北恩施两试验点，抗病亲本R225均表现一致，评价病情指数为18.15、感病亲本掖478均表现为高感，评价病情指数为89.03、F1表现中抗、F2:3群体病情指数介于11.11～100，连续分布。笔者试验测得各个点2次重复家系单株病级，计算病情指数(图2)，结果表明，病情指数在群体不同家系间分离比较明显，不同环境下表现比较一致。

2.3 抗尾孢灰斑病QTL 分析

利用复合区间作图法进行抗病QTL初步定位，综合2点联合QTL检测结果，其中有多个QTL在2个环境都能检测到，分别位于2、5、8、9染色体上，可分别解释4.78%～37.77%的表型变异，尤其是第2染色体上的QTL“qRcz2”效应明显，多个环境都能检测到，是一个可靠的主效QTL。

表1 玉米尾孢菌灰斑病 QTLs 的定位情况

3 讨论

利用分子标记技术对数量性状位点(quantitative trait locus, QTL)进行分析和定位是抗性遗传研究的经典方法。近年来已在玉米上对若干控制主效抗病基因或数量性状位点进行了分析和定位[13～19]，如：丝黑穗病、大斑病、穗腐病、小斑病、粗缩病、茎腐病、粗缩病。近年来，针对玉米灰斑病开展了大量的抗病基因定位和发掘工作。定位了多个抗病相关QTL位点，获得了一批抗病候选基因[20～23]。目前报道多数是关于玉蜀黍尾孢菌灰斑病抗性QTL研究，而关于玉米尾孢菌QTL分析研究较少。由于试验所用材料、鉴定环境和方法的不同，所检测的QTL都不完全一致，尚未取得相对一致且较完善的结论。

笔者研究主要针对近几年玉米尾孢菌C. zeina引起的灰斑病进行QTL分析，对国内外种质资源经过多年多点的抗灰斑病鉴定，筛选出优良自交系R225(高抗材料)，通过与掖478(高感材料) 配制作图群体F2(345个单株)、性状评价群体F2:3，根据两年3点抗灰斑病鉴定结果进行QTL初定位，确定了抗性QTL相关信息[24]，研究结果以摘要形式在2015年中国植物保护学会论文初报，本文做详细报道。笔者研究结果与已报道的抗玉米尾孢菌C. zeina灰斑病QTL位点有所不同[25]，尤其是第2染色体上的QTL(命名为“qRcz2”)效应明显，后期通过回交群体进行验证，是一个主效QTL。研究结果丰富了玉米尾孢菌抗性遗传研究，对玉米灰斑病的控制有重要意义。