胡著云，周琼

（1.江西中医药大学附属医院，南昌330006；2.南昌市第三医院，南昌330000）

前列腺癌（ PCa）是老年男性常见肿瘤，其死亡率也位于肿瘤疾病第二位。 加之近年来随着生活环境的改变及普查力度的提高， 前列腺癌的发病率呈上升趋势。 临床治疗前列腺癌的方法包括内手术、化疗、内分泌疗法、以及放射等多种疗法。这些疗法均具有一定的局限性， 其中手术治疗效果差，化疗药物难以进入前列腺癌组织，内分泌治疗虽可改善患者症状， 但在接受治疗的1-3 年后几乎所有患者会转变为雄激素非依赖性前列腺癌（AIPC），平均预期生存时间小于1 年[1]。 因此，寻找能有效防治前列腺癌的新型药物成为临床急需解决的问题。

既往研究表明， 肿瘤组织生长和转移的过程中，肿瘤细胞增殖与凋亡之间的动态平衡发挥着重要作用。 白藜芦醇（resveratrol）是虎杖的主要活性成分，研究表明其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗自由基等多种功效，其中白藜芦醇的抗肿瘤活性已成为当前研究的热点[2,3]。 基于此，本研究通过动物实验研究探讨白藜芦醇诱导前列腺癌PC-3 系细胞凋亡的作用及其机制， 旨在为临床防治前列腺癌提供新的思路和依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 无特殊病原体(SPF) 级BALB／C成年雄性裸鼠，体重为18-22g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.1.2 细胞及试剂 人前列腺癌PC-3 细胞株购自中科院昆明细胞库；DMEM 培养基、胎牛血清购自Gibco 公司；β-actin 抗体，小鼠存活素(survivin)单抗、小鼠抗人bcl-2 单抗均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.1.3 中药药材 中药虎杖产地为江西樟树， 经江西中医药大学中药鉴定与炮制专家鉴定为廖科植物虎杖。 采用醇提-树脂分离工艺提取药物中的白藜芦醇成分， 并采用萃取和硅胶柱层析相结合的方法，最终得到含90%白藜芦醇的提取物。

1.2 实验方法

1.2.1 建立裸鼠模型 将人前列腺癌PC-3 细胞株常规培养、传代后，取对数生长期的PC-3 细胞消化，计数活细胞数在98%，调整浓度为（5-10）×106/ml，取0.2ml 细胞悬液接种于裸鼠背部皮下当移植瘤长至1×1cm 时开始治疗。

1.2.2 分组治疗 选取48 只已长瘤裸鼠， 实体瘤体积和体重接近，随机分为空白组、对照组以及治疗A、B、C、D 共6 组，每组8 只。 其中空白组生理盐水0.1 ml/只，腹腔注射，每3 天一次，共10 次；对照组：丙二醇0.1 ml/只，腹腔注射，每3 天一次，共10 次；治疗A 组：白藜芦醇25mg/kg，溶于0.1 ml 丙二醇中，腹腔注射，每3 天一次，共10 次；治疗B 组： 白藜芦醇50mg/kg， 溶于0.1 ml 丙二醇中，腹腔注射，每3 天一次，共10 次；治疗C 组：白藜芦醇100mg/kg， 溶于0.1 ml 丙二醇中， 腹腔注射，每3 天一次，共10 次；治疗D 组：白藜芦醇200mg/kg，溶于0.1 ml 丙二醇中，腹腔注射，每3天一次，共10 次。

1.3 观察指标 ⑴分别于第5d、第10d、第20d 以及第30d 测量并记录肿瘤体积[肿瘤体积（mm3）=长径(mm)×短径2(mm2)×0.5)]。⑵治疗结束后处死裸鼠，剥离瘤体称重后计算抑瘤率。 抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)／对照组平均瘤重×100%。 ⑵取下肿瘤组织，采用Western blot 检测各组肿瘤标本的Bcl-2 和Survivin 的表达情况。操作方法：每组分别取肿瘤组织40mg，低温匀浆器研磨后提取总蛋白60μg 上样，经PAGE 电泳、脱脂奶粉封闭、孵育过夜等程序后，采用增强化学发光法检测目标蛋白，其中蛋白含量相对值=蛋白光密度值/β-actin 光密度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，多组间采用方差检验，计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇对移植瘤肿瘤体积的影响 对照组裸鼠平均肿瘤体积从 (160.48±17.46)mm3增长到(1149.3±221.3)mm3；空白组和对照组不同时期移植瘤肿瘤体积比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗组A 和B 组中，随着时间的推移，移植瘤肿瘤体积增加，不同时间段间比较差异显著（P＜0.05）；随着白藜芦醇浓度的增加，移植瘤肿瘤体积明显下降，各组间比较差异显著（P＜0.05）。 见表1。

表1 不同组别移植瘤肿瘤体积比较（±s），mm3

表1 不同组别移植瘤肿瘤体积比较（±s），mm3

组别 5d 10d 20d 30d对照组空白组治疗组A 组B 组C 组D 组160.48±17.46 161.07±19.01 325.74±24.95 334.61±22.98 857.13±76.94 867.94±77.30 1149.31±221.37 1204.28±234.16 123.24±20.07 114.95±18.63 104.15±17.57 95.52±15.26 249.34±23.94 186.37±21.86 153.07±20.04 117.28±16.31 519.36±42.38 264.27±29.34 194.38±22.08 130.71±17.05 702.19±68.37 311.75±34.19 226.07±27.64 157.33±20.14

2.2 白藜芦醇对移植瘤平均肿瘤重量及抑瘤率的影响 对照组移植瘤肿瘤平均重量为 （0.562±0.005）g， 对照组和空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗组A-D 组中，随着白藜芦醇浓度的增加， 移植瘤肿瘤重量明显下降， 抑瘤率明显提高，各组间比较差异显著（P＜0.05）。 见表2。

2.3 不同组别Bcl-2 和Survivin 表达比较 对照组和空白组Bcl-2 和Survivin 表达明显，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）； 治疗组移植瘤组织中Bcl-2 和Survivin 表达不同程度减少， 并呈剂量依赖性，随着白藜芦醇浓度的增加，Bcl-2 和Survivin蛋白的平均光密度均明显下降， 各组间比较差异显著（P＜0.05）。 见表3。

表2 不同组别移植瘤肿瘤重量比较（±s）

表2 不同组别移植瘤肿瘤重量比较（±s）

组别 平均肿瘤重量(g) 抑瘤率(%)对照组空白组治疗组A 组B 组C 组D 组0.562±0.005 0.571±0.005——0.446±0.004 0.382±0.004 0.319±0.003 0.256±0.002 20.64 32.03 43.24 54.45

表3 不同组别Bcl-2 和Survivin 表达比较

3 讨论

细胞凋亡是程序性细胞死亡过程， 其中由凋亡产生的损伤作用与肿瘤的发生关系密切， 同时凋亡产生的损伤作用也是恶性肿瘤发展的关键特征之一，因此，诱导肿瘤细胞凋亡是有最有效的化疗策略。 细胞凋亡通常由内源和外源两种途径来介导，Survivin（存活素），属凋亡抑制蛋白，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能， 其在正常成人组织中几乎不表达， 但在大多数肿瘤中可重新出现。 研究表明，Survivin 具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能， 与前列腺癌的发生密切相关。 国外研究表明，Survivin 在前列腺癌的高水平表达与肿瘤的分期、 分级明显相关[4]。Elena 等通过抑制survivin 基因导致细胞活性降低，最终则导致Hela 细胞线粒体跨膜电位缺失、细胞自发性凋亡。 Bcl-2 蛋白是第一个确认能对抗细胞凋亡的基因，是细胞凋亡的关键调控者[5]。 其作用机制是通过线粒体外膜达到调节细胞凋亡。 研究表明Bcl-2 过表达促进了前列腺癌的发生和发展，同时也与疾病的临床病理特征有关[6,7]。

基于以上理论， 临床研究治疗前列腺癌的关键在于寻找能有效干预细胞凋亡抑制蛋白的药物。 白藜芦醇是虎杖的主要活性成分， 具有抗肿瘤、抗氧化、抗自由基、和免疫调节等作用，已被证明对乳腺癌、 卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞具有明显的抑制作用[8-10]。 为进一步探讨白藜芦醇抗前列腺癌的可能机制， 本研究对其进行裸鼠动物实验研究。 研究中将48 只长瘤裸鼠分为六组，结果表明， 空白组和对照组移植瘤肿瘤体积、Bcl-2 和Survivin 蛋白表达差异均无统计学意义。 治疗组给予不同剂量的白藜芦醇，25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg 以及200mg/kg 移植瘤肿瘤体积依次递减，抑瘤率依次递增，并呈剂量依赖性，各组间比较差异显著（P＜0.05），进一步证明表明白藜芦醇对前列腺肿瘤有抑制作用。 此外，通过对白藜芦醇抑瘤机制的分析， 结果显示治疗组中， 白藜芦醇25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg 以 及200mg/kg 移 植 瘤 组 织 中Bcl-2 和Survivin 表达不同程度减少， 各组间比较差异显著（P＜0.05），并呈剂量依赖性，随着白藜芦醇浓度的增加，Bcl-2 和Survivin 蛋白的平均光密度均明显下降。由此表明白藜芦醇对PC-3 细胞具有显著的细胞毒作用， 并以剂量依赖性方式通过诱导细胞凋亡来抑制PC-3 细胞的增殖，其机制可能与白藜芦醇通过抑制Bcl-2 和Survivin 蛋白的表达而阻断信号通路有关。