郑丽丽，张玲，黄荳，罗琳，李伟，冯旭辉

（江西省妇幼保健院药剂科，南昌330006）

雌激素水平参与了学习、 记忆等脑功能的调节。 女性绝经后雌激素的缺乏可引起记忆力和认知功能的衰减，增加了阿尔茨海默病（AD）的发病风险。 中药在改善认知、改善学习记忆障碍方面的研究受到了越来越多的关注[2]。 茯苓（poria cocos）为多孔菌科真菌茯苓[poria cocos (schw)wolf]的干燥菌核。 目前对于含有茯苓的复合物改善学习记忆方面作用的研究逐渐增多， 但茯苓单药的作用效果及可能作用机制却鲜有报道。 因此本研究通过去卵巢大鼠建立低雌激素记忆障碍模型 （戊酸雌二醇组为阳性对照组），观察茯苓对去卵巢大鼠在Morris 水迷宫中空间学习记忆能力的影响，并观察各组动物脑中与学习记忆功能密切相关的BDNF、TrkB 蛋白表达水平的变化， 探讨茯苓改善绝经后妇女认知功能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6-8 个月龄SPF 级雌性SD 大鼠，体质量180-200g， 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（京）2014-0001， 于江西省精神病院实验动物中心饲养。

1.2 药物及试剂 茯苓 （中国食品药品检定研究院，批号：121117-201910）；戊酸雌二醇片（拜耳药业，批号：455A）；0.9%氯化钠溶液（江西通达药业，批 号：1903143301）；BDNF、pTrkB、TrkB、actin 抗体：购自Santa cruz 公司。

1.3 模型制作 大鼠禁食24 h， 禁水8 h， 用10%水合氯醛（3ml·kg-1）进行麻醉，打开腹腔对双侧卵巢进行切除。假手术组仅切除卵巢周边部分脂肪组织，缝合腹壁，禁食24 h。

1.4 分组与给药 将60 只实验大鼠随机分为为模型组、假手术组、戊酸雌二醇（0.8mg/kg）、茯苓低、中、高 剂 量 组（0.3g/kg、0.6g/kg、1.2g/kg），每 组10只。 模型组和假手术组灌胃0.9%氯化钠溶液10 ml·/kg，每日给药1 次，连续5 周。

1.5 Morris 水迷宫实验 水温为19℃-20℃，水池包括I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 个象限。 定位航行实验：将水下平台置于某一象限（在训练的5d 中位置固定不变）。大鼠分别从4 个不同象限面对池壁放入水中，找到平台后，记录逃避潜伏期，如果大鼠在60s 内未找到平台，逃避潜伏期标记为60s。 5d 的定位航行实验后撤掉水下平台进行空间探索实验， 记录大鼠60s 内穿越原平台区域的次数。

1.6 样本收集 大鼠麻醉后， 沿中线剪开头皮，暴露并剪开头盖骨，掀开脑膜，将脑剥离，沿大脑矢状线分别往左右两边分开大脑皮层，分离出海马，收集海马，-80℃保存备用。

1.7 Western blotting 法检测BDNF 和TrkB 蛋白及其磷酸化表达水平 精密称取海马组织，研磨并用RIPA 裂解液裂解组织，离心取上清液。 考马斯亮蓝法测定蛋白含量。 取样品加入上样缓冲液混合，煮沸5min，电泳，转膜，用5%脱脂牛奶封闭1h。 一抗4℃孵育过夜， 上二抗室温孵育1h，TBST 漂洗15min×3 次。 电致化学发光显色，定影，分析灰度值。

1.8 统计学分析 采用SPSS 21．0 软件进行统计学分析，所有数据均采用(±s)表示，采用单因素方差分析，组间均值进行t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水迷宫法观察茯苓对大鼠学习、记忆功能的影响 与模型组相比，假手术组、茯苓中、高剂量组和戊酸雌二醇组均能明显减少训练第6 天大鼠第1次经过平台的时间（逃避潜伏期），差异具有统计学意义（P＜0.05）。 空间探索实验结果显示，与模型组相比，假手术组、茯苓中、高剂量组和戊酸雌二醇组跨越平台次数明显增加， 差异具有统计学意义（P＜0.05）。 见表1。

2.2 western-blot 技术检测各组大鼠海马组织内蛋白水平变化 与假手术组相比，模型组海马组织中BDNF 蛋白及TrkB 蛋白的磷酸化表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），但对TrkB 蛋白总蛋白的表达水平无明显影响， 差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，茯苓中、高剂量组和戊酸雌二醇组均能明显增加BDNF 蛋白及TrkB 蛋白的磷酸化的表达水平，差异具有统计学意义（P＜0.05），但对TrkB 蛋白总蛋白的表达水平无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见图1。

表1 各组大鼠水迷宫测试结果（n=10±s）

与模型组比较：*1P＜0.05

测试指标 逃逸潜伏期（s） 经过平台次数（次）假手术组模型组阳性对照组茯苓治疗低剂量中剂量高剂量6.12±1.65*1 2.17±0.87 7.24±3.22*1 2.98±1.67 7.11±3.49*1 7.89±3.66*1 11.35±5.87*1 25.36±10.28 13.66±8.94*1 20.53±6.17 14.11±6.52*1 12.68±6.08*1

图1 6 组大鼠蛋白BDNF、TrkB、pTrkB 表达（n=10±s）

3 讨论

茯苓是一种常用中药， 主要成分为三萜类和多糖类，具有增强免疫功能、利尿、抗炎、保肝、抗衰老等药理作用[3]。 茯苓改善学习记忆方面的研究近些年逐渐增多。 含茯苓的中药方剂不忘散可以明显改善绝经模型大鼠的认知能力[4]。 茯苓复合物如远志茯苓醇提物能改善学习记忆障碍模型小鼠的学习记忆能力[5]。 人参-茯苓药可以多途径、多通路治疗老年性痴呆[6]。 据中草药相关文献分析：茯苓常用于老年性痴呆及其他原因造成的学习记忆能力的提高[2,7]。目前包含茯苓的复方制剂如安坤颗粒、 坤泰胶囊等中成药已经广泛用于绝经前后诸症。Morris 水迷宫试验主要用于评价药物对空间学习记忆能力获得的影响。 本实验研究证明： 茯苓能明显缩短Morris 水迷宫试验中去卵巢大鼠逃避潜伏期，增加跨越平台次数。 因此茯苓对去卵巢大鼠模型的学习和记忆能力具有促进作用。

脑源性神经营养因子（brain—derived neurotrophic factor，BDNF）是人体内含量最为丰富的神经营养因子，主要分布在海马和大脑皮质。 其中与TrkB 受体结合是BDNF 最主要的信号通路，BDNF 与TrkB 受体结合后， 通过激活下游的信号转导通路在神经重塑、 理解和记忆方面扮演重要角色[8]。BDNF 与TrkB 通过参与神经细胞的生长发育及调节突触可塑性等方面， 可调节大脑海马区的学习记忆功能[9]。 本实验研究证明：模型组海马组织中BDNF 蛋白及TrkB 蛋白磷酸化的表达水平明显降低， 而茯苓可以上调BDNF 蛋白及TrkB蛋白磷酸化的表达水平。

综上所述，茯苓能够通过激活BDNF／TrkB 信号通路来促进去卵巢模型鼠学习、记忆能力。 茯苓作为一种有效的益智中药单方制剂，对于AD 患者尤其是绝经后妇女记忆障碍的患者， 具有重要的临床治疗意义。