张卫玮，李芬，钟幸

(1.江西卫生职业学院，南昌330052；2.江西省肿瘤医院淋巴血液科，南昌330029；3.江西省惠民医院，南昌330046)

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤， 其死亡率占女性癌症相关死亡率的第二位,晚期乳腺癌预后较差，临床上迫切需要寻找新的治疗靶点[1-3]。DNA 损伤反应调节基因1 (regulated in DNA damage and development1，REDD1) 在正常组织中REDD1 低表达，而当组织缺氧、细胞应激、DNA 损伤可诱导REDD1 高表达[4]。 研究表明，REDD1 是一种新的癌基因，与肿瘤发生、发展、放化疗敏感性密切相关,抑制REDD1 表达可促进中卵巢癌、肾癌、头颈部鳞癌等细胞凋亡、抑制细胞增殖，然而其在乳腺癌中的作用及机制尚不明确[5-7]。 磷脂酞肌醇3 激酶(PI3K)在肿瘤细胞调节中起着重要作用[8,9]。 REDD1 是PI3K/AKT 通路的重要调控蛋白，REDD1 可磷酸化激活PI3K/AKT 通路， 抑制细胞凋亡、促进细胞增殖，帮助肿瘤细胞在不良环境中存活[10,11]。 本研究拟从REDD1 介导PI3K/AKT 通路调控乳腺癌细胞凋亡的角度，阐述REDD1 在乳腺癌中的生物学功能及机制，为乳腺癌提供潜在的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料和组织标本 收集2017 年1 月-2018 年1 月江西省肿瘤医院粗针穿刺活检诊断为浸润性乳腺癌患者的术后新鲜标本30 例（乳腺癌肿瘤组织及其相应的癌旁正常组织），检测其组织中REDD1 蛋白、mRNA 表达水平。 本研究的伦理批准由江西肿瘤医院伦理委员会提供。

1.1.2 细胞及主要试剂 人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231 细胞由江西省肿瘤转化医学重点实验室提供。 DMEM 细胞培养基、胎牛血清等购自ThermoFisher 公司。 兔抗人REDD1 单克隆抗体、 兔抗人PI3K 单克隆抗体、 兔抗人AKT 及pAKT 单克隆抗体、 兔抗人Caspase3 单克隆抗体、兔抗人Bcl-xl 抗体、 兔抗人β-actin 及HRP 偶联的抗兔IgG 二抗均购自CellSignaling 公司。 RNA提取及RT-qPCR 试剂盒购自ThermoFisher 公司。siRNA 及Hiperfect 转染试剂购自ThermoFisher 公司。 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒购自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞株MCF-7 和MDA-MB-231 细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM, 于37℃含5%CO2的饱和湿度细胞培养箱中培养。 待细胞生长覆盖70%-80%瓶底面积时，用于实验操作或传代。

1.2.2 siRNA 转染 将MCF-7 和MDA-MB-231 细胞按5×104/孔的密度分别接种于6 孔板中，待细胞融合度为30%-50%时， 使用Hiperfect 转染试剂，分别转染siRNA- REDD1/NC， 放入细胞培养箱培养48h，进行后续实验操作。

1.2.3 Western-blot 提取各处理组蛋白，等量蛋白样品经SDS-PAGE 电泳后， 稳流将蛋白转至甲醇预处理的PVDF 膜上，转膜、封闭后按流程分别加入一抗(1:1000) 和二抗(1:5000)。 于MYECL Imager系统曝光。

1.2.4 RNA 提取和逆转录-定量PCR (RT-qPCR)总RNA 提取使用TRIzol， 逆转录及扩增反应采用RT-qPCR 试剂盒（SYBR Green）。 逆转录(20μl 体系)：42℃1h, 95℃10min。 qPCR (10μl 体系)：95℃3min，95℃15s，60℃30s，再循环扩增39 次。 基因相对表达水平采用2-ΔΔCq 计算方法。 引物序列如下:

1.2.5 细胞凋亡检测 取对数生长期各处理组细胞制成单细胞悬液，Cell Staining Buffer 洗2 次，加入100μl Binding Buffer、5μl Annexin V-FITC、10ul PI, 室温避光30min， 检测前加入400μl Binding Buffer，1h 内上机检测细胞凋亡。 每组设3 孔平行样。 使用FlowJo 软件进行数据分析。

2 结果

2.1 REDD1 在乳腺癌组织中高表达 在25 对乳腺癌及其癌旁组织，RT-qPCR 结果提示REDD1 mRNA 在乳腺癌组织中表达水平显著高于癌旁组织(图1A)。 在5 对乳腺癌（T）及其癌旁正常组织（N），Western-blot 结果显示REDD1 蛋白在乳腺癌组织中表达水平显著高于癌旁正常组织(图1B)。

图1 REDD1 在乳腺癌组织中过表达。（A）RT-qPCR 检测25 例乳腺癌组织及其癌旁正常组织中REDD1 mRNA 表达水平。（B）Western-blot 检测5 例乳腺癌组织及其癌旁正常组织中REDD1蛋白表达水平

2.2 siRNA-REDD1 成功下调REDD1 表达水平为了进一步探索REDD1 生物学功能， 我们使用siRNA-REDD1/NC 转染MCF-7 和MDA-MB-231细胞，siRNA-REDD1 成功下调REDD1 蛋白及mRNA 表达水平(图2A&B)。

图 2 MCF-7 和 MDA-MB-231 细 胞 分 别 转 染siRNA-REDD1/NC。（A）RT-qPCR 检测转染后REDD1 mRNA表达水平（B）Western-blot 检测转染后REDD1 蛋白表达水平

2.3 下调REDD1 促进乳腺癌细胞凋亡 使用siRNA-REDD1/NC 分别转染MCF-7 和MDA-MB-231 细胞后， 流式AnnexinV-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡率（±s）。 结果显示(图3A)，MCF-7 细胞中对照组（REDD1-NC）凋亡率为(16.5±5.08)%，而REDD1 下调组凋亡率明显升高，为(29±2.08)%；同样，在MDA-MB-231 细胞中，对照组凋亡率为(17.4±1.38)%，而REDD1 下调组凋亡率(36.7±1.25)%。同时，我们检测了凋亡蛋白cleaved caspase3(断裂caspase3)和凋亡抑制蛋白Bcl-xl 表达水平，结果显示（图3B），REDD1 下调组抗凋亡蛋白BCL-xl 下降，cleaved-capase3 上升。

图 3 MCF-7 和 MDA-MB-231 细 胞 分 别 转 染siRNA-REDD1/NC。（A）AnnexinV-FITC/PI 双染法检测各组细胞凋亡率。（B）Western-blot 检测MCF-7 细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase3 和BCL-xl

2.4 下调REDD1 抑制PI3K/AKT 通路蛋白表达水平 为了探讨下调REDD1 促进细胞凋亡的分子作用机制，使用siRNA-REDD1/NC 转染MCF-7 细胞后行western-blot 检测PI3K、AKT、pAKT 蛋白表达水平。结果显示，siREDD1 组PI3K、pAKT 蛋白表达水平低于NC 组，AKT 蛋白表达无差异。 提示下调REDD1 可抑制PI3K/AKT 通路磷酸化激活(图4)。

图4 MCF-7 细胞转染siRNA-REDD1/NC，Western-blot检测凋亡相关蛋白PI3K/AKT 通路蛋白表达

3 讨论

DNA 损伤反应调节基因1 ( regulated in DNA damage and development 1，REDD1 )是Shoshani 等在研究神经胶质瘤细胞乏氧时发现的、 因细胞缺氧诱导表达的一种基因。 在人体正常组织中，REDD1 广泛低表达， 然而在肿瘤组织中，REDD1常呈现高表达，REDD1 高表达有助于帮助肿瘤细胞在组织乏氧、能量压力、DNA 损害等的不良环境中存活[12]。 然而，REDD1 在肿瘤中可兼具抑癌、促癌功能， 表现在不同肿瘤、 不同环境中的功能不同。 研究表明REDD1 过表达可介导PI3K/AKT 促进前列腺细胞凋亡抵抗[10]，而另有研究却显示乏氧状态可诱导REDD1 高表达、抑制mTOR，抑制前列腺癌细胞增殖[13]。 在卵巢癌中，REDD1 是ras 介导的人卵巢上皮是细胞癌变转化的重要因子，REDD1 高表达可促进卵巢上皮细胞增殖、 抑制细胞凋亡[12,14]。 沉默REDD1 可抑制细胞自噬提高膀胱癌化疗敏感性[15]。 然而，在乳腺癌中的作用及机制尚不明确。

本研究首先检测了乳腺癌组织及癌旁组织中REDD1 表达水平，发现乳腺癌组织中REED1 在基因及蛋白水平上均明显高于癌旁正常组织， 提示REDD1 在乳腺癌中的作用可能为癌基因, 与孙丽丽等在卵巢癌中的研究结果一致[16]。进一步功能学研究显示，使用siRNA 下调REDD1 表达后，乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 细胞凋亡率明显升高，凋亡蛋白cleaved-caspase3 升高，而凋亡抑制蛋白Bcl-xl 下降，抑制REDD1 表达可促进乳腺癌细胞凋亡，提示REDD1 可能参与调控乳腺癌细胞凋亡途径。 然而，本研究未构建REDD1 过表达模型，具有一定的局限性，后续研究将进一步完善。

在乳腺癌中，P13K/AKT 信号通路激活与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、转移等恶性表型密切相关。癌基因过表达或抑癌基因突变均可上调PI3K/AKT通路表达，促进乳腺癌细胞恶性表型[17-20]，PI3K 抑制剂LY294002 可显著性下调PI3K/AKT 通路从而抑制乳腺癌生长[21-23]。 本研究结果显示,下调RED D1 表达可抑制PI3K/AKT 通路磷酸化激活， 促进乳腺癌细胞凋亡， 说明REDD1/PI3K/AKT 是调控乳腺癌细胞凋亡途径的通路之一，但PI3K/AKT 通路是否为REDD1 主要的分子调控通路，还需要进行阻断-恢复实验进一步论证。

综上，REDD1 在乳腺癌中高表达， REDD1 介导PI3K/AKT 通路调控乳腺癌细胞凋亡途径，REDD1 可能为乳腺癌潜在新的靶基因。