陈 丽 朱美娟 陈 娟 应海玲 唐文庄

急性肾损伤(AKI)是临床上一种较为常见的危急重症，由各种致病原因造成双肾功能在短期内(数小时至数周)急剧减退[1-2]，可进展为慢性肾脏病及终末期肾病，严重威胁患者的生命安全及生活质量[2]。近年来有研究发现线粒体相关的细胞凋亡通路是AKI早期肾小管细胞功能受损及丢失的重要因素[3]。Pleckstrin同原序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase,PHLLP)家族成员PHLPP2[4]，是靶向调控Akt磷酸化的特异性分子，已在多种细胞证实能影响线粒体功能，促进细胞的凋亡[5]。有研究证实，PHLLP在炎症性肠病中通过抑制Akt活性，导致肠上皮细胞的过度凋亡，加重肠上皮屏障功能损伤[6]。而在桑色素对肝损伤的保护机制研究中发现，桑色素能够通过干预PHLPP2的活性，继而通过PHLPP2-Akt-Gsk3β信号通路抑制氧化应激和线粒体功能损伤来保护肝功能[7]。上述研究均提示PHLPP2可能通过影响线粒体功能参与AKI的发病过程中，但关于PHLPP2在AKI中的研究尚无相关报道。本实验拟通过PHLPP2敲除(PHLPP2-/-)小鼠以顺铂(cisplatin,CDDP)诱导经典小鼠AKI模型，观察并探究PHLPP2在AKI过程中的作用及其相关机制。

材料与方法

材料SPF级成年雄性C57BL/6小鼠20只，8～12周龄，购自海南医学院实验动物中心；PHLPP2-/-小鼠20只由上海南方模式生物科技公司定制；4%甲醛(武汉博士德生物公司)；顺铂(cisplatin,CDDP)(宜昌人福药业有限公司)；CCK-8试剂盒(北京索莱宝生物公司)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司)；大鼠抗PHLPP2、GAPDH单克隆抗体(美国Abcam公司)；Alexa Fluor 647标记的兔抗大鼠抗体(美国Biolegend公司)； TUNEL凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)；FITC标记的麦胚凝集素(WGA)(美国Invitrogen公司);BAC 法蛋白质定量试剂、DAPI染料、磷酸化蛋白提取试剂盒、HE染色试剂盒(江苏碧云天生物公司); 免疫组织化学染色试剂盒(北京博奥森生物公司)；二氨基联苯胺(DAB) 染色剂购自(北京中杉金桥)；JC-1线粒体膜电位试剂盒(美国Biovision公司)；其余均为国产分析纯。

方法

AKI动物模型建立和分组 实验动物分为WT对照组、WT CDDP处理组、PHLPP2-/-对照组和PHLPP2-/-CDDP处理组(每组10只)。小鼠适应性喂养1周后，参考相关文献进行制备AKI小鼠模型：术前12h禁食不禁水，经腹注射戊巴比妥钠(150 mg/kg)进行麻醉后，将稀释后的CDDP(1 g/L)按20 mg/kg的剂量进行单次腹腔注射，对照组注射相同体积的生理盐水。造模后自由摄食水。3d后心尖采血后处死小鼠，取双肾组织，右肾置于-80℃保存备用，左肾剥除肾脏外膜后固定于4%甲醛中。

血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)及总蛋白含量测定 于本院罗氏全自动生化分析仪中分析各组小鼠血清中BUN、SCr及总蛋白含量。

病理学染色 取固定于甲醛溶液24h后的肾组织，进行处理切片后行HE染色，每只小鼠随机选取3张切片，光镜下观察其组织学变化。

反转录PCR检测肾组织中PHLPP2 mRNA表达 将小鼠肾组织置于液氮中研磨为组织匀浆后按照TRIzol法提取组织中总RNA，分光光度计检测浓度与纯度后，根据逆转录试剂说明书逆转录为cDNA.再按照RT-PCR试剂说明书及预实验确定的反应时间与温度进行实时定量。上述实验单独重复3次。

TUNEL试剂盒检测肾组织中凋亡细胞 各组小鼠肾组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后按照TUNEL试剂盒说明书进行检测肾皮质组织的细胞凋亡情况。在各组小鼠的肾组织切片中加入FITC标记的WGA(10 μg/ml)，孵育30 min后，Hank’s平衡液洗涤未结合的凝集素，加入TUNEL反应液及DAPI染液，继续孵育1h后，加入防荧光淬灭剂进行封片，荧光显微镜进行观察。细胞凋亡率计算为：高倍视野下每100个细胞中TUNEL染色阳性的细胞数。以上实验单独重复3次。

荧光免疫组织化学染色检测肾组织中PHLPP2的定位与表达 各组小鼠肾组织中切片常规脱蜡水化、抗原修复后， PBS漂洗组织，加入5% BSA于室温下孵育20 min进行封闭，滴加稀释后的兔抗PHLPP2多克隆抗体(1∶ 200)并于4℃下进行孵育过夜，次日37℃复温后，PBS漂洗组织，加入Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔抗体(1∶ 800)并在室温下孵育30 min，再次PBS漂洗后加入5 μg/ml的DAPI染液，室温孵育30 min，PBS漂洗后加入防荧光猝灭剂，荧光显微镜观察。

小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelium cells，RTECs)分离 参考相关文献报道方法[8]分离各组小鼠肾小管上皮细胞。FITC标记的抗E黏连蛋白于室温孵育分离的RTECs 20 min，随后应用FITC标记细胞角蛋白18/DAPI进行免疫染色进行鉴定RTECs。RTECs培养于含10%FBS、1%ITS、10%EGFG、100 ng/ml氢化可的松及1%青链霉素的DMEM/F12培养液中。

透射电镜观察线粒体超微结构 取上述各组小鼠肾脏皮质组织，常规处理后制成超薄切片，于电子显微镜下观察肾脏组织超微结构变化。

JC-1法检测RTECs中线粒体膜电位 取各组小鼠RTECs，参考JC-1试剂盒说明方法应用流式细胞术进行检测细胞线粒体膜电位变化。实验单独重复3次。

Western Blot实验 利用蛋白质提取试剂盒提取各组小鼠肾脏总蛋白。BCA法进行蛋白定量，按照1∶ 4向上清液中加入5×上样缓冲液，并于沸水中加热变性10 min。取30 μg的蛋白进行SDS-PAGE分离蛋白，采用湿转法将分离蛋白转至PVDF膜上，5%的脱脂牛奶于室温下封闭2h后，分别加入PHLPP2(1∶ 500)、GAPDH(1∶ 2 000)一抗，4℃摇床孵育过夜。加入HRP标记的二抗(1∶ 5 000)室温孵育1h，最后在载有蛋白条带的PVDF膜上均匀滴加ECL发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照。Image J软件测定条带灰度值，以目标蛋白与内参GAPDH的比值作为其相对含量。以上实验单独重复3次。

统计分析采用《SPSS 19.0》和《GraphPad Prism 5.0》进行统计分析，数据结果用均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较进行分析；P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

敲除PHLPP2改善CDDP诱导的AKI 与WT对照组小鼠相比，WT CDDP组与PHLPP2-/-CDDP组小鼠BUN、SCr含量显著升高(P<0.05)，总蛋白含量显著降低(P<0.05)，PHLPP2-/-对照组无明显变化(P>0.05)；WT CDDP组小鼠相比，PHLPP2-/-CDDP组小鼠血清中BUN、SCr含量明显降低(P<0.05)，而总蛋白含量显著升高(P<0.05)(表1)；光镜下见WT对照组与PHLPP2-/-对照组小鼠肾脏组织结构正常，肾小管上皮细胞排列整齐；WT CDDP组小鼠的肾脏组织中肾小管出现坏死，上皮细胞肿胀、变性，肾小管腔内可见玻璃样管型，管腔明显扩张，而PHLPP2-/-CDDP组小鼠的肾组织损伤较WT CDDP组明显减轻(图1)。

表1 各组小鼠血清中BUN、SCr和总蛋白含量检测结果

图1 各组小鼠肾脏组织病理学改变(A～D：HE×200;E～H:HE×400)WT:野生型小鼠;PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶2；CDDP:顺铂

PHLPP2在CDDP诱导的AKI中显著高表达RT-PCR与Western Blot实验显示，WT CDDP处理组小鼠肾组织中PHLPP2的mRNA(4.35±0.33)与蛋白(0.71±0.16)较与WT对照组的PHLPP2 mRNA(1.05±0.04)和蛋白(0.16±0.04)表达均显著增高(P<0.01);免疫组织化学染色结果显示PHLPP2在WT CDDP处理组小鼠肾皮质组织处的肾小管上皮中的表达明显增加(图2)。

图2 小鼠肾组织中PHLPP2的表达及定位(IHC,×200)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶2；CDDP:顺铂;WT:野生型小鼠;**:与WT组相比,P<0.01

敲除PHLPP2减轻CDDP诱导的细胞凋亡各组小鼠肾组织经TUNEL染色后结果显示，WT对照组与PHLPP2-/-对照组小鼠肾脏组织中无明显凋亡现象发生；与WT对照组相比，WT CDDP组小鼠的肾组织的凋亡细胞显著增加(P<0.01)；与WT CDDP组小鼠的肾组织相比，PHLPP2-/-CDDP组小鼠肾组织凋亡细胞明显减少(P<0.05，图3)。

图3 各组小鼠肾组织的TUNEL染色(TUNEL,×40)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶2；CDDP:顺铂;WT:野生型小鼠；*:与WT组相比， P<0.05，**:P<0.01；#:与WT CDDP组相比，P<0.05

敲除PHLPP2改善CDDP诱导的线粒体损伤免疫荧光鉴定分离的RTECs，结果显示分离的细胞80%以上均表达肾小管上皮细胞特异性标志分子角蛋白18，这提示分选的RTECs纯度能够满足后续实验研究。透射电镜观察各组小鼠RTECs超微结构改变，结果表明WT与PHLPP2-/-组小鼠线粒体结构完整，外膜光滑无肿胀；WT CDDP组小鼠RTECs线粒体结构大量破坏，数目显著减少，棘突排列紊乱，线粒体膜破损严重；PHLPP2-/-CDDP组小鼠可见RTECs线粒体结构多数完整，棘突变短，其线粒体损伤介于WT组与WT CDDP组之间(图4)。

图4 透射电镜观察各组小鼠肾组织中线粒体结构变化(EM)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶2；CDDP:顺铂;WT:野生型小鼠；RTECs:肾小管上皮细胞

敲除PHLPP2减轻CDDP诱导的线粒体损伤JC-1法检测各组小鼠RTECs的线粒体膜电位变化，其中FL2与FL1双阳性象限为线粒体膜电位较高的正常细胞，而FL1单阳性象限为线粒体膜电位降低的受损细胞。JC-1实验结果显示结果表明与WT组相比，WT CDDP组、PHLPP2-/-CDDP组小鼠RTECs线粒体膜电位显著下降(P<0.05)；但与WT CDDP组相比，PHLPP2-/-CDDP组细胞线粒体膜电位下降趋势明显缓解(P<0.05，图5)。

图5 PHLPP2诱导CDDP介导急性肾损伤中RTECs线粒体膜电位降低(JC-1法检测)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶2；CDDP:顺铂;RTECs:肾小管上皮细胞;WT:野生型小鼠；与WT组相比，*：P<0.05，**:P<0.01；#:与WT CDDP组相比，P<0.05

PHLPP2基因对凋亡蛋白表达的影响Western Blot检测各组小鼠RTECs中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Akt的Thr308与Ser473位点磷酸化水平，结果显示与WT对照组与PHLPP2-/-对照组细胞相比，WT CDDP组和PHLPP2-/-CDDP组RTECs中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表达显著增加(P<0.05)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.05)；与WT CDDP组相比，PHLPP2-/-CDDP组中Bax、Caspase-3 表达明显减少(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.05)；Akt的Thr308与Ser473位点磷酸化水平的检测结果显示，与WT对照组与WT CDDP组的相比，PHLPP2-/-对照组及PHLPP2-/-CDDP组的RTECs中上述位点磷酸化水平显著增加(P<0.05)，这提示PHLPP2基因通过对Akt的Thr308与Ser473位点去磷酸化发挥上述作用(图6)。

图6 PHLPP2基因对CDDP介导急性肾损伤中RTECs凋亡蛋白表达的影响(Western印迹)PHLPP2:Pleckstrin同原序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶2；CDDP:顺铂;RTECs:肾小管上皮细胞;*：A：WT对照组;B:WT CDDP组;C:PHLPP2-/-对照组;D:PHLPP2-/-CDDP组；*：与WT组相比， P<0.05；#:与WT CDDP组相比，P<0.05

讨 论

AKI是临床常见的危急重症，其在重症监护室患者中的发病率超过50%[9]。此外，AKI还会增加慢性肾脏病的发病风险并且是其进展的独立危险因素[10]。AKI发病原因复杂，其中缺血、感染以及肾毒性药物等原因是导致AKI发生及死亡率增高的重要影响因素[11]。

线粒体是广泛存在于细胞中的一种重要细胞器，在生理水平下线粒体处于稳定状态，但当其损伤时，可产生大量超氧化物和活性氧，导致钙超载和氧化应激等不良刺激，从而诱导细胞发生凋亡和坏死[12]。肾脏线粒体含量丰富，其密度仅次于心脏，诸多数据表明AKI模型中可见肾小管上皮细胞线粒体嵴消失、线粒体碎片化及数量减少、膜损伤等现象，这提示线粒体结构损伤及功能障碍在AKI发病过程中可能起着重要的作用[13]。线粒体通透性转换孔(MPTP)是线粒体功能的关键调节因子，其能够决定线粒体通透性，在细胞受到不良刺激后MPTP异常开放可导致线粒体膜电位下降乃至消失，继而引发线粒体肿胀，外膜破裂并致使线粒体结构损害，影响线粒体功能，进而诱导细胞发生凋亡[14]。在缺血再灌注的小鼠AKI模型中，以环孢素A处理同样能够抑制MPTP的开放，保护线粒体功能而改善AKI损伤，且在敲除CypD基因表达的AKI模型小鼠中也观察到MPTP开放介导的肾小管上皮细胞发生凋亡途径被抑制[15-16]。

PHLPP2是基于对Akt磷酸化调控的机制分析，通过理论推断和实验鉴定所得的蛋白[4]。Akt激酶通过磷酸化级联反应可直接调控下游促凋亡和抗凋亡两类转录因子的活性，从而决定细胞命运归向[17]。PHLLP主要通过使Akt的Thr308与Ser473位点去磷酸化而终止下游的信号传导[4]。在多种实体瘤中(如乳腺癌、结肠癌)PHLPP2的缺失导致细胞中的Akt持续磷酸化，进而促进肿瘤细胞的增殖，并抑制其发生凋亡。在本实验在PHLPP2基因敲除的小鼠通过顺铂诱导AKI模型，该操作简单，侵入性损害较小且所诱导的AKI效果明显。随后实验鉴定AKI模型小鼠BUN、SCr和总蛋白水平均呈现异常，且PHLPP2-/-小鼠中PHLPP2的mRNA及蛋白表达均显著降低，免疫组化显示PHLPP2在损伤较严重的皮质部位显著增加，而PHLPP2-/-小鼠中肾组织损伤明显减轻，TUNEL染色同样证实在PHLPP2-/-的小鼠中细胞的凋亡发生率显著降低，进一步的线粒体结构及功能实验结果表明敲除小鼠PHLPP2基因表达能够抑制肾小管上皮细胞中线粒体MPTP的开放，抑制线粒体膜电位的下降，从而保护线粒体结构及功能，最后Western Blot实验检测结果显示敲除PHLPP2基因表达可显著促进小鼠RTECS中Bcl-2蛋白表达，而抑制Bax、Caspase-3蛋白表达，且PHLPP2基因是通过对Akt的Thr308与Ser473位点去磷酸化而调节上述蛋白表达。这与既往的研究结果一致[5]。

综上，本研究发现敲除PHLPP2表达能够减轻线粒体膜电位的下降，保护线粒体的结构及功能，从而通过抑制线粒体途径的凋亡改善AKI损伤。本研究不仅为PHLPP2与线粒体功能之间的相互作用关系提供了新的思路，同时也对AKI发展的分子机制提供了新的见解，因此PHLPP2有望成为治疗AKI的潜在研究靶点。