李飞鹤 ，韩 波 ，佘 梅 ，张俊英

（1.山西振东制药股份有限公司，山西太原 030001； 2.山西中医药大学，山西晋中030619）

草莓系蔷薇科草莓属植物Fragaia ananassaDuch.的果实，又称凤梨草莓，原产南美［1］，我国以及欧洲等地广为栽培食用，以其怡人的芳香气味和鲜红滑嫩的果肉及丰富的营养价值吸引着万千食客，营养价值高，含有多种营养物质，被大量应用到各类食品中，长期食用有保健功效。功效主要归因于草莓富含花青素（anthocyanidin），花青素也称花色素，为黄酮类多酚化合物，属于植物中的水溶性色素，主要用于植物染料和抗氧化食品、化妆品中。据报道，花青素具有抗氧化、清除自由基、抗炎、保护心血管、降血糖、降血脂、保护视力、认知调节功能等功效［2-6］。已知20多种花青素中，矢车菊素在植物中分布最广［7］，因此本文选取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷作为目标物研究。尽管测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的方法已有研究［8-9］，但系统性不够，且每一种样品化学成分有异，建立定量的测定方法需单独研究。本文采用HPLC检测方法测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量，作为控制草莓质量的一个指标，同时也为草莓、杨梅、枸杞、蓝莓等富含花青素的浆果类提供花青素测定的参考方法，为选择花青素提取原料，开拓花青素的应用市场，提供一定的参考依据。

1 实验材料

1.1 药材与试剂

草莓鲜果由山西农业大学提供，经山西中医药大学裴妙荣教授鉴定为蔷薇科植物草莓的果实。冻干品制备：鲜草莓切片，预冻1 h，冷冻干燥45 h，粉碎机粉碎，再继续冻18 h，直至草莓粉在空气中不会吸潮粘合，保存在-20℃冰箱备用。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品（纯度99.05%），Cas number：7084-24-4，购自上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.2 实验仪器

沃特世高效液相色谱仪，PDA检测器，色谱柱：Kromasil 100-5-C18，5 μm（4.6 mm×250 mm），Phenomenex Luna C18，5 μm （4.6 mm×250 mm），Agilent ZORBAX SB-C18，5 μm（4.6 mm×250 mm）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流速0.5 mL/min，检测波长517 nm，以乙腈作为流动相A，1%磷酸水溶液作为流动相B，梯度洗脱方法见表1。

表1 梯度洗脱方法

2.2 对照品溶液的制备

取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品约15 mg，精密称定，置于50 mL的容量瓶中，用2%的盐酸甲醇溶液溶解并定容至刻度作为母液，精吸5 mL母液于25 mL的容量瓶中，用2%的盐酸甲醇溶液定容至刻度，制成每1 mL含60 μg对照品的溶液备用。

2.3 供试品溶液的制备

取草莓粉约0.5 g，精称，置带盖离心管中，分别精密加入2%的盐酸甲醇溶液5 mL，称定重量，分别提取4次，每次提取完毕，放冷，以相应溶剂补足减失的重量，离心20 min，取上清液，最后合并上清液作为供试品溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 专属性试验

采用2.1项下的色谱条件，分别吸取2.2项下的对照品溶液和2.3项下的供试品溶液，其色谱图及紫外吸收光谱，见图1～2，测定波长选用517 nm，专属性良好。

2.5 精密度试验

取2.3项下供试品溶液，连续进样6针，依法测定，结果表明精密度符合测定要求，RSD为0.56%。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液 10 μL，于配制后 0，2，4，6，8，10，12，24 h 依法测定，结果表明，供试品溶液在24 h内基本稳定，RSD为1.64%，能满足测定要求。

图1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品溶液色谱图及紫外吸收光谱

2.7 标准曲线

取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对照品1.54 mg，精称，置于25 mL的容量瓶中，用2%的盐酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别精密量取对照品溶液 1，2，3，5，7，9，10 μL，按 2.1项下色谱条件测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为：y=3 000 000x-79.8，相关系数r=1.000 0（n=7）。结果表明矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在 0.024 608～0.246 080 μg 呈良好的线性关系。

2.8 重复性试验

取同批次草莓粉6份，平行测定，结果矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的平均含量为0.273 mg/g，RSD为1.1%，该方法的重复性良好。

2.9 回收率

采用加标回收法，取已知含量的同一批样品（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量为0.273 mg/g）精密称定，按以下方案进行试验：①取约125 mg精密加入对照品溶液（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.001 538 mg/mL）20 mL；②取约250 mg精密加入对照品溶液（含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.003 076mg/mL）20 mL；③取约500 mg精密加入对照品溶液（含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷0.006 152 mg/mL）20 mL，照2.3项下方法制备供试品溶液，把提取溶剂换作对照品溶液，各平行制备3份，依法测定，RSD值为1.76%，表明该方法的准确度良好，数据见表2。

2.10 样品测定

照“2.3”项下制备供试品溶液，按拟定方法测定不同批次的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量，测定样品共8批，每份样品平行做3份，结果见表3。

3 讨论

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为植物中普遍存在的花青素成分，本实验首次以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为对照品，建立了简单易行、准确的HPLC定量测定方法。本实验所采用的草莓冻干品保持原有化学成分与鲜果相同，按照前述方法对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷进行含量测定，其测定结果百分含量为0.013 5%～0.033 2%，该方法也可为蓝莓、枸杞、杨梅、紫薯、甘蓝、葡萄皮等花青素的测定提供一定的参考依据。

表2 加样回收试验

表3 样品中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量测定结果

在HPLC法测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的研究中，考察了不同比例甲醇和乙醇的提取效率；提取酸度，如0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%、3%的盐酸甲醇溶液；提取时间，如超声 10、20、30、40 min；提取次数，如 1、2、3、4 次等，结果确定了 2%的盐酸甲醇溶液超声提取4次，每次20 min提取效率最高，且峰形最佳。

采用文献［10］方法考察，耐用性结果矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在各种色谱柱均分离良好，不同色谱柱间测定含量的RSD为3.02%，表明新建方法有较好的耐用性。