林文 曹珈琪 张燕

[摘要]细胞焦亡是一种由炎症小体驱动的程序性非典型细胞死亡模式，由Caspase-1/-11/-4/5介导。Gasdermin家族蛋白是近年发现的致孔效应蛋白家族，该家族蛋白通常处于自抑制状态，被称为是细胞焦亡的“刽子手”，其中最为重要的焦亡执行蛋白是Gasdermin D和Gasdermin E。发生细胞焦亡时，激活的Caspases将GSDMD/GSDME切割为N端孔洞形成片段和C端抑制片段，造成膜穿孔，释放炎症因子等细胞内容物引发细胞焦亡。随着细胞焦亡的深入研究，发现其在多种疾病尤其是肿瘤发生发展中扮演着重要的角色。本文总结了细胞焦亡的分子机制及其在癌症中的研究进展。

[关键词]细胞焦亡;细胞程序性死亡;炎症小体;肿瘤;GSDMD

[中图分类号] R737.25          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）9（c）-0025-05

[Abstract] Pyroptosis is a pattern of atypical cell death driven by inflammasome， mediated by Caspase-1/-11/-4/5. Gasdermin family proteins are identified as pore-forming proteins acting as the "executor" of pyroptosis， which usually remain in self-suppressed state. Gasdermin D and Gasdermin E are the most key palyers in pyroptosis. In the pathway of pyroptosis， GSDMD/GSDME is cleaved into N-terminal pore-forming fragments and C-terminal inhibitory fragments by activated Caspases， membrane perforation is initiated in turn， and cell contents such as inflammatory factors are released to trigger pyroptosis. Emerging evidences support that pyroptosis plays an important role in the development of various diseases， especially in tumors. This article summarizes the underlying molecular mechanism of pyroptosis and reviews the research progress in cancer.

[Key words] Pyroptosis; Programmed cell death; Inflammasome; Tumor; GSDMD

在生物个体的生长和发育期间，细胞死亡随时都会发生，这是生物界普遍存在的生命现象，在多细胞生物的生长、发育和体内平衡中起着重要作用。细胞死亡的方式主要分为两类，非程序性死亡和程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]，PCD又可分为非炎症反应介导的自噬（autophagy）和凋亡（apoptosis）及炎癥反应介导的细胞焦亡[2]。近年来，细胞焦亡成为PCD领域的研究热点，随着调控焦亡的信号通路逐渐阐明，研究人员也发现细胞焦亡在人类多种疾病中所产生的巨大影响。

1细胞焦亡的研究历史

细胞焦亡伴随着炎症反应的细胞死亡方式早在20世纪90年代就已被关注，1992年Zychlinsky等[3]首次发现，用侵袭性志贺菌和鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞可诱导宿主细胞死亡，主要观察到宿主细胞DNA片段化和膜起泡，最初认为是凋亡所致，但由于Caspase-3被裂解是晚期事件，并且死亡过程需要Caspase-1的参与，从而引起广泛的关注，随后在1994～2000年，进一步的分析表明，巨噬细胞的死亡独特地依赖于Caspase-1而不是凋亡相关Caspase，并且伴随着细胞膜的破坏和炎症细胞因子和其他小分子的释放[4-5]。2001年Cookson及其同事将这种依赖于炎性体的细胞死亡称为“pyroptosis”，源于希腊语中与火或热有关的“pyro”[6]，至此细胞焦亡被明确定义。此后，虽然有大量关于焦亡的报道，但直到2015年Gasdermin D（GSDMD）被发现为Caspase-1和Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的切割靶点时，细胞焦亡的关键因子才被发现，GSDMD被称为焦亡的“刽子手”[7]。随着研究的深入，Gasdermin超家族中其他蛋白，如Gasdermin E（GSDME），被Caspase-3激活，也会诱发细胞焦亡[8]。在2018年，细胞死亡命名委员会（Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD）定义细胞焦亡是由Gasdermin蛋白家族成员形成质膜穿孔的炎症细胞PCD[9]。如今细胞焦亡这种程序性细胞死亡方式已经逐渐被人们所了解，越来越多的研究发现细胞焦亡在人类癌症、自身免疫性疾病、神经系统相关疾病中均发挥着重要的作用。

2细胞焦亡分子机制

2.1模式识别受体与炎症小体

免疫系统以天然免疫和适应性免疫两种免疫方式保护着人体，二者均依赖特异性受体对“非我”分子模式进行识别，随后利用不同的机制消除携带模式分子的病原体[10]。其中作为宿主防御的第一道防线的天然免疫通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原体特有保守的关键模式分子，病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）以及内源性危险信号分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），立即引发机体反应，以遏制入侵的微生物，为激活随后的适应性免疫反应奠定基础[11]。胞浆中的PRRs包括Toll样受体（TLRs）、细胞内核苷酸结合寡聚结构域（NOD）样受体（NLRs）和AIM2样受体（ALRs）[12]。

炎症小体在细胞质中以多蛋白复合物状态存在，由信号特异性传感器蛋白，衔接子蛋白，以及效应蛋白构成[13]。信号特异性传感器蛋白主要是富含中央核苷酸结合域（nucleotide binding domain，NBD）和亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat，LRR）的NOD-like receptor，NLR蛋白家族（NLRP1、NLRC4、NLRP3、NAIP2/5）和HIN-200蛋白家族（hematopoietic IFN-inducible nuclear antigen with 200 amino acid repeats），如（AIM2），衔接子蛋白则是含有Caspase激活募集域（Caspase activation and recruitment domain，CARD）的凋亡相关微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC），Caspase为效应蛋白[14]。

2.2 Caspase-1介导的经典途径细胞焦亡

Caspase（cysteinyl aspartate specific proteinase）是一种含有半胱氨酸的内源性天冬氨酸蛋白水解酶，是生物体通过调节细胞死亡和炎症来维持稳态的重要基因家族[15]。Caspase已被广泛分类为凋亡性（哺乳动物中Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8和Caspase-9）和炎症性（人类Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-12和小鼠Caspase-1、Caspase-11和Caspase-129）[16]。细胞焦亡则是由Caspase所介导发生的，其中经典途径的细胞焦亡由Caspase-1介导，非经典细胞焦亡途径由Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介导。

Caspase-1在通常状态下作为一种惰性酶原存在，是炎症小体的重要组成部分。当胞浆PRRs受到特定PAMPs和DAMPs的刺激下，PRR通过（或不通过）ASC和Pro-Caspase-1形成组装成为炎症小体，炎症小体通过反平行二聚作用形成Caspase-1酶原激活平台，该反向平行二聚作用使一个Caspase-1分子的催化结构域与需要切割以激活该酶的两个位点之一接近，随后Caspase-1会自剪切激活，从酶原变为具有活性的蛋白水解酶，这是细胞焦亡发生重要的一环[17]。激活后的Caspase-1不仅可以介导促炎症细胞因子[白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）]的成熟和分泌，还可以直接作用于GSDMD[18]。Caspase-1在其中央连接区将自抑制状态下的GSDMD切割为具有穿孔活性的31KDa氨基末端（NT）和22KDa的羧基末端（CT），随后，GSDMD-N通过膜脂相互作用方式，与细胞膜内表面的磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰丝氨酸结合，并在脂质双层中形成内径10～20 nm寡聚孔，细胞膜上的穿孔可直接释放被Caspase-1激活的分子直径约为5 nm的IL-1β和IL-18以及其他小的胞浆蛋白，如小GTP酶、半乳糖凝集素或半胱氨酸型内肽酶抑制剂胱抑素等。除此之外，质膜上大量的孔洞在膜的内侧和外侧之间引起连通，形成了非选择性的膜通道，使质膜两侧离子浓度失衡，大量的水进入细胞，细胞肿胀，内容物逸出，细胞最终死亡[7，19-20]。不仅如此，焦亡细胞所释放的IL-1β、IL-18是内源性免疫因子，引起发热和刺激免疫细胞活化，促进淋巴细胞增殖和分泌抗体。IL-1β和IL-18的失控释放会导致广泛的炎症反应和免疫性疾病[21]。

2.3非经典途径的细胞焦亡

非经典的焦亡途径，通常是细胞质脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）直接激活Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介导焦亡，Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11可以直接被细胞内革兰阴性细菌LPS刺激，以激活和水解自身的蛋白酶活性[22]。活化的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11也可以作用于GSDMD并产生与Caspase-1相同的裂解作用，从而导致细胞膜穿孔。激活的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11在NLRP3和ASC存在下可以与Caspase-1相互作用，从而促进其激活[23-24]。同样的，Caspase-1裂解IL-1β和IL-18的前体以形成活性IL-1β和IL-18，通过GSDMD-NT形成的膜通道释放并引起焦亡。与经典途径不同的是，在非经典的细胞焦亡中，仅IL-1β和IL-18前体的裂解取决于Caspase-1，GSDMD的切割则是由其他已激活的炎症性Caspases完成的[25]。

3细胞焦亡与癌症的发生

近年研究显示，多种癌症的发生及治疗与细胞焦亡密切相关。Wang等[26]研究表明，细胞焦亡关键蛋白GSDMD可能通过抑制ERK、STAT3和PI3K通路，进而抑制CyclinA2/CDK2复合物，导致细胞周期S/G2期阻滞，抑制胃癌增殖。Gao等[27]研究表明，与癌旁组织相比，非小细胞肺癌中的GSDMD蛋白表达水平显著上调，经临床数据分析，较高水平的GSDMD表达与患者肿瘤体积成正相关，并且影响着患者晚期的肿瘤淋巴结转移。敲低GSDMD表达后抑制了小鼠肿瘤的生长。

GSDMD/GSDME是细胞焦亡发生的关键蛋白，因此大量研究靶点在于小分子或药物触发GSDMD介导的焦亡作用而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力等。Wang等[28]发现二甲双胍（Metformin）可诱发GSDMD介导的焦亡。Pizato等[29]发现Omega-3 二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）可以在MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞中引发焦亡，与未经处理的细胞相比，经DHA处理的乳腺癌细胞发生了细胞焦亡，Caspase-1、GSDMD被激活，IL-1β分泌增加。Deng等[30]最近的一项研究发现，BIX-01294，一种二氮杂-喹唑啉-胺衍生物可诱导自噬通量，并且当BIX联合顺铂（Cis-platinum，Cis）处理胃癌细胞，可以诱导GSDME介导的胃癌细胞发生焦亡。Chen等[31]的一项研究发现，与结直肠癌一样，洛铂会通过Caspase-3/GSDME信号传导途径在鼻咽癌细胞中诱导焦亡。海洋耐寒细菌假海变单胞菌TAC125产生的4-羟基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid，4-HBA），可诱导A549肺上皮癌细胞焦亡。研究发现4-HBA处理A549细胞后，可以激活Caspase-1，促使IL-18和IL-1表达增加，誘导肺腺癌细胞焦亡，进而促进细胞死亡[32]。花青素是属于类黄酮家族的天然着色剂，其抗癌特性引起了科学界的广泛关注[33]。Yue等[34]注意到花青素降低了口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）细胞的活性，抑制了细胞的迁移和侵袭能力。花青素处理OSCC时，NLRP3、Caspase-1和IL-1的表达增强，激活细胞焦亡，同时，在Caspase-1抑制剂的作用下，花青素激活的细胞焦亡被抑制，而细胞活力、迁移和侵袭率随之提高。化疗耐药是卵巢癌患者最常见的死亡原因之一，确定新型抗肿瘤药物是当务之急。Qiao等[35]研究发现新型分子α-NETA[2-（anaphthoyl）ethyltrimethylammonium iodide]通过GSDMD/Caspase-4途径诱导上皮性卵巢癌（EOC）细胞焦亡。此外，Caspase-4或GSDMD的敲低都会影响细胞α-NETA细胞的抑制活性，表明α-NETA通过焦亡途径发挥作用。最近的另一研究发现[36]，大气压冷等离子体（cold atmospheric plasma，CAP）已被提出作为一种新的有前途的抗癌治疗方法。在CAP诱导的细胞死亡中已经揭示了细胞凋亡和坏死，但是CAP是否诱导细胞焦亡仍然未知。Yang等[36]研究发现CAP通过线粒体途径的激活（JNK/细胞色素C/Caspase-9/Caspase-3）和GSDME的裂解，在高表达GSDME的肿瘤细胞系中以剂量依赖性方式有效诱导了细胞焦亡，揭示了GSDME可能是未来癌症CAP治疗中预后的潜在生物标志物。在结直肠癌中，Yu等[37]发现，洛铂呈剂量依赖性降低了HT-29和HCT116细胞的活力，从形态学上看，洛铂处理的HT-29和HCT116细胞在显微镜下表现为细胞肿胀，细胞膜上出现大气泡，透射电镜显示细胞膜上有多个孔。机制上，洛铂诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高和JNK磷酸化。活化的JNK将Bax引入线粒体，刺激细胞色素c向细胞质释放，进而诱导Caspase-3和Caspase-9裂解，从而发生细胞焦亡。Wang等[38]研究发现在胃癌细胞株SGC-7901和MKN-45中使用5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）可以诱导Caspase-3的裂解，从而使GSDME的N末端片段积累，导致胃癌细胞焦亡。此外，CRISPR-Cas9敲除GSDME可将5-FU诱导的Caspase-3依赖性焦亡转变为凋亡。真核延伸因子-2激酶（eukaryotic elongation factor-2 kinase，eEF-2K）是一种蛋白合成的负调控因子，已被证明在各种应激下肿瘤细胞自噬和凋亡中发挥重要作用[39]。在最近的一项研究中，eEF-2K在阿霉素诱导的人类黑色素瘤细胞焦亡中发挥重要作用，eEF-2K沉默导致焦亡作用增强，从而使黑色素瘤细胞对阿霉素敏感，表明靶向eEF-2K可能增强阿霉素的抗肿瘤作用，为肿瘤化疗提供了新的方向[40]。

4小結

细胞焦亡是新近发现的一种促炎性、程序性细胞死亡方式。经典细胞焦亡途径依赖于Caspase-1的介导，非经典细胞焦亡途径依赖于Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的介导。经过近年的研究，焦亡的特征已有较一致的认识，机制研究也取得的重大突破，多项研究也表明了细胞焦亡参与了各种疾病的发展。目前对于不同疾病中细胞焦亡发生的机制尚未完全明确，进一步探究细胞焦亡在不同疾病，特别是肿瘤中的效应机制，以及相关上下游信号转导通路的蛋白，对于全面认识这一新型的细胞死亡方式，对于新型药物的开发，寻找疾病治疗的新靶点具有重要意义。

[参考文献]

[1]Hotchkiss RS，Strasser A，McDunn JE，et al.Cell death[J].N Engl J Med，2009，361（16）：1570-1583.

[2]Vande Walle L，Lamkanfi M.Pyroptosis[J].Curr Biol，2016，26（13）：R568-R572.

[3]Zychlinsky A，Prevost MC，Sansonetti PJ.Shigella flexneri induces apoptosis in infected macrophages[J].Nature，1992， 358（6382）：167-169.

[4]Hilbi H，Chen Y，Thirumalai K，et al.The interleukin 1beta-converting enzyme，caspase 1，is activated during Shigella flexneri-induced apoptosis in human monocyte-derived macrophages[J].Infect Immun，1997，65（12）：5165-5170.

[5]Hersh D，Monack DM，Smith MR，et al.The Salmonella invasin SipB induces macrophage apoptosis by binding to caspase-1[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96（5）：2396-2401.

[6]Cookson BT，Brennan MA.Pro-inflammatory programmed cell death[J].Trends Microbiol，2001，9（3）：113-114.

[7]Shi J，Zhao Y，Wang K，et al.Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death[J].Nature，2015，526（7575）：660-665.

[8]Wang Y，Gao W，Shi X，et al.Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin[J].Nature，2017，547（7661）：99-103.

[9]Galluzzi L，Vitale I，Aaronson SA，et al.Molecular mechanisms of cell death：recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018[J].Cell Death Differ，2018，25（3）：486-541.

[10]Tomar N，De RK.A brief outline of the immune system[J].Methods Mol Biol，2014，1184：3-12.

[11]Takeuchi O，Akira S.Pattern recognition receptors and inflammation[J].Cell，2010，140（6）：805-820.

[12]He Y，Hara H，Núez G.Mechanism and Regulation of NLRP3 Inflammasome Activation[J].Trends Biochem Sci，2016， 41（12）：1012-1021.

[13]Schroder K，Tschopp J.The inflammasomes[J].Cell，2010， 140（6）：821-832.

[14]Broz P，Dixit VM.Inflammasomes：mechanism of assembly，regulation and signalling[J].Nat Rev Immunol，2016，16（7）：407-420.

[15]Shalini S，Dorstyn L，Dawar S，et al.Old，new and emerging functions of caspases[J].Cell Death Differ，2015，22（4）：526-539.

[16]Shi J，Zhao Y，Wang Y，et al.Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS[J].Nature，2014， 514（7521）：187-192.

[17]Lamkanfi M，Dixit VM.Mechanisms and functions of inflammasomes[J].Cell，2014，157（5）：1013-1022.

[18]He WT，Wan H，Hu L，et al.Gasdermin D is an executor of pyroptosis and required for interleukin-1β secretion[J].Cell Res，2015，25（12）：1285-1298.

[19]Chen X，He WT，Hu L，et al.Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis[J].Cell Res，2016， 26（9）：1007-1020.

[20]Shi J，Zhao Y，Wang K，et al.Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death[J].Nature，2015，526（7575）：660-665.

[21]Kayagaki N，Stowe IB，Lee BL，et al.Caspase-11 cleaves gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling[J].Nature，2015，526（7575）：666-671.

[22]England H，Summersgill HR，Edye ME，et al.Release of interleukin-1α or interleukin-1β depends on mechanism of cell death[J].J Biol Chem，2014，289（23）：15 942-15 950.

[23]Man SM，Kanneganti TD.Gasdermin D：the long-awaited executioner of pyroptosis[J].Cell Res，2015，25（11）：1183-1184.

[24]Aglietti RA，Dueber EC.Recent Insights into the Molecular Mechanisms Underlying Pyroptosis and Gasdermin Family Functions[J].Trends Immunol，2017，38（4）：261-271.

[25]Feng S，Fox D，Man SM.Mechanisms of Gasdermin Family Members in Inflammasome Signaling and Cell Death[J].J Mol Biol，2018，430（18 Pt B）：3068-3080.

[26]Wang WJ，Chen D，Jiang MZ，et al.Downregulation of gasdermin D promotes gastric cancer proliferation by regulating cell cycle-related proteins[J].J Dig Dis，2018，19（2）：74-83.

[27]Gao J，Qiu X，Xi G，et al.Downregulation of GSDMD attenuates tumor proliferation via the intrinsic mitochondrial apoptotic pathway and inhibition of EGFR/Akt signaling and predicts a good prognosis in non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep，2018，40（4）：1971-1984.

[28]Wang L，Li K，Lin X，et al.Metformin induces human esophageal carcinoma cell pyroptosis by targeting the miR-497/PELP1 axis[J].Cancer Lett，2019，450：22-31.

[29]Pizato N，Luzete BC，Kiffer L，et al.Omega-3 docosahexaenoic acid induces pyroptosis cell death in triple-negative breast cancer cells[J].Sci Rep，2018，8（1）：1952.

[30]Deng BB，Jiao BP，Liu YJ，et al.BIX-01294 enhanced chemotherapy effect in gastric cancer by inducing GSDME-mediated pyroptosis[J].Cell Biol Int，2020，44（9）：1890-1899.

[31]Chen Z，Xu G，Wu D，et al.Lobaplatin induces pyroptosis through regulating cIAP1/2，Ripoptosome and ROS in nasopharyngeal carcinoma[J].Biochem Pharmacol，2020，177：114 023.

[32]Sannino F，Sansone C，Galasso C，et al.Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 produces 4-hydroxybenzoic acid that induces pyroptosis in human A459 lung adenocarcinoma cells[J].Sci Rep，2018，8（1）：1190.

[33]de Sousa Moraes LF，Sun X，Peluzio M，et al.Anthocyanins/anthocyanidins and colorectal cancer：What is behind the scenes？[J].Crit Rev Food Sci Nutr，2019，59（1）：59-71.

[34]Yue E，Tuguzbaeva G，Chen X，et al.Anthocyanin is involved in the activation of pyroptosis in oral squamous cell carcinoma[J].Phytomedicine，2019，56：286-294.

[35]Qiao L，Wu X，Zhang J，et al.α-NETA induces pyroptosis of epithelial ovarian cancer cells through the GSDMD/caspase-4 pathway[J].FASEB J，2019，33（11）：12 760-12 767.

[36]Yang X，Chen G，Yu KN，et al.Cold atmospheric plasma induces GSDME-dependent pyroptotic signaling pathway via ROS generation in tumor cells[J].Cell Death Dis，2020， 11（4）：295.

[37]Yu J，Li S，Qi J，et al.Cleavage of GSDME by caspase-3 determines lobaplatin-induced pyroptosis in colon cancer cells[J].Cell Death Dis，2019，10（3）：193.

[38]Wang Y，Yin B，Li D，et al.GSDME mediates caspase-3-dependent pyroptosis in gastric cancer[J].Biochem Biophys Res Commun，2018，495（1）：1418-1425.

[39]Bircan HA，Gurbuz N，Pataer A，et al.Elongation factor-2 kinase （eEF-2K） expression is associated with poor patient survival and promotes proliferation，invasion and tumor growth of lung cancer[J].Lung Cancer，2018，124：31-39.

[40]Yu P，Wang HY，Tian M，et al.Eukaryotic elongation factor-2 kinase regulates the cross-talk between autophagy and pyroptosis in doxorubicin-treated human melanoma cells in vitro[J].Acta Pharmacol Sin，2019，40（9）：1237-1244.

（收稿日期：2020-06-22）