安静静，王俊祺，肖 园，陆文丽，李 林，王 伟，董治亚

（上海交通大学医学院附属瑞金医院儿科，上海 200025）

小于胎龄（small for gestational age,SGA）儿为出生体质量和（或）身长在同胎龄出生体质量和（或）身长平均值的-2SD（低于2 个标准差）以下，或低于第10 百分位的新生儿[1]。大多数SGA 儿在生后早期会出现自发性的生长追赶 （catch-up growth，CUG），但约有13%的患儿没有明显的生长追赶（non-catch-up growth，NCUG），从而导致幼儿在2 岁时的身高仍然在同龄儿身高-2SD 水平以下[2]。2 岁时未能实现CUG 的SGA 儿，其成年期身材矮小的风险将会大大增高。

CUG 一直是SGA 研究的热点。近年来，肠道菌群对于生长的作用已有较多研究报道，有研究显示肠道菌群与生长间有一定的关联[3-6]。本研究建立了SGA 大鼠模型，比较CUG-SGA 组与NCUG-SGA 组幼鼠间的肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）变化，分析肠道菌群与CUG间的关系，尝试阐明肠道菌群在SGA 大鼠幼鼠CUG 中的作用及其可能的机制。

材料与方法

一、材料

本研究采用上海交通大学医学院附属瑞金医院实验动物中心提供的无特定病原体Sprague-Dawley 大鼠进行实验。实验内容及过程经上海交通大学医学院附属瑞金医院动物实验伦理委员会审批通过。

二、方法

1.SGA 大鼠幼鼠模型的建立：本实验采用孕鼠全程半限制饮食法诱导建立SGA 大鼠幼鼠模型。选取成年雌鼠15 只，雄鼠5 只，雌雄3∶1 比例合笼过夜自然交配，次日早上雌鼠阴道涂片，以阴道涂片显微镜下看到精子为受孕第1 天，将受孕雌鼠单笼饲养。其中，5 只雌性孕鼠为正常对照组，受孕后自由饮食，自然分娩；10 只雌性孕鼠为SGA 模型组，受孕后第1 天开始限制饮食，以正常对照组孕鼠前一日食量的50%为投喂饲料量（约10 g），自然分娩。SGA 模型组孕鼠分娩仔鼠的出生体重和身长低于对照组孕鼠分娩仔鼠体重和身长的-2SD 时，判断为SGA 仔鼠。

2.分组：分娩后，所有母鼠均给予自由饮食。所有新生幼鼠前3 周龄进行母乳喂养，后改为正常饲料喂养，每周监测其体重、身长，满4 周龄时幼鼠的体重及身长均低于正常对照组体重及身长的-2SD者判定为NCUG-SGA 幼鼠，其余则为CUG-SGA幼鼠。

3.血清分离：幼鼠满4 周龄时，予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，用眼球采血法采集血标本，置于EP 管中，静置2 h 后分离血清，并储存于-80 ℃下。

4.粪便标本获取：幼鼠满4 周龄时，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，并仰卧位解剖，用无菌镊子将回盲段内的成形粪便取下，置于EP 管内，并立即置于-80 ℃冰箱内冷冻保存，待后续进行微生物群落和代谢物SCFA 分析。

5.胰岛素样生长因子1 （insulin-like growth factor 1，IGF-1）检测：采用酶联免疫吸附试验法检测幼鼠血中的IGF-1 水平。

6.肠道菌群及粪便SCFA 检测：从2 组幼鼠中各随机选取5 只（共10 只，均来自不同饲养笼），收集其粪便用于16S rRNA 测序和粪便代谢产物SCFA 检测。

（1）粪便基因组DNA 提取及16S rRNA 测序：16S rRNA 测序送至上海派森诺生物科技有限公司进行测定，全程按照操作规范及试剂盒说明书操作，进行粪便微生物总基因组DNA 提取。采用引物520 正向引物（5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′）和802反向引物（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）对细菌16S rRNA 基因的V4 区进行扩增。使用Illumina MiSeq 系统进行双端测序。

（2）生物信息分析：运用QIIME 软件，并调用USEARCH 将问题序列剔除，得到高质量序列用于后续分析。利用Vsearch 软件将相似性大于97%的序列聚类为一个操作分类单元，使用QIIME 软件软件及Perl 脚本，分析Alpha 和Beta 多样性，应用LefSe 分析寻找2 组之间的差异菌属。

（3）粪便代谢物SCFA 检测：准备适量用研钵研碎的幼鼠粪便，加入15%的磷酸50 μL，混匀后在低温下离心，取其上清液进行气相色谱-质谱检测。称量乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸标准品，用乙醚配置成0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL 共9 个 混合标准浓度梯度。采用Agilent 7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪进行分析，使用MSD ChemStation软件提取色谱峰面积及保留时间等原始数据处理后定量分析。

结 果

一、SGA 幼鼠模型的建立

10 只限制饮食组孕鼠共产下SGA 仔鼠70 只，满4 周龄时54 只存活，存活率为77.1%。满4 周龄时，30 只（55.6%）实现CUG（CUG-SGA 组），另24 只未实现CUG（NCUG-SGA 组）。CUG-SGA 组幼鼠出生时的体重及身长与NCUG-SGA 组间比较，差异无统计学意义（P 均＞0.050）；满4 周时CUG-SGA 组幼鼠的体重及身长与NCUG-SGA 组比较，差异有统计学意义（P 均＜0.001）（见表1）。

二、2 组幼鼠的血IGF-1 水平

满4 周龄时，CUG-SGA 组幼鼠的平均血IGF-1水平为（250.41±85.66） μg/L，而NCUG-SGA 组幼鼠的平均血IGF-1 水平为（112.29±32.26） μg/L，2 组间差异有统计学意义（P=0.021）。

三、2 组幼鼠的肠道菌群多样性分析

采用Simpson 指数分析比较2 组幼鼠的肠道菌群Alpha 多样性，结果显示，CUG-SGA 组幼鼠肠道菌群的Simpson 指数均值为0.99，显著高于NCUG-SGA 组的0.97 （P=0.009）（见图1），提示CUG-SGA 组幼鼠肠道菌群的群落多样性高于NCUG-SGA 组。同时，CUG-SGA 组幼鼠肠道菌群Simpson 指数的离散程度显著小于NCUG-SGA 组，提示CUG-SGA 组幼鼠个体间的肠道菌群差异小于NCUG-SGA 组。

图1 2 组幼鼠肠道菌群Simpson 指数比较

采用基于未加权UniFrac 距离的主坐标分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）研究NCUGSGA 组与CUG-SGA 组幼鼠的肠道菌群组成（Beta多样性）差异，结果表明，CUG-SGA 组幼鼠肠道菌群的β 多样性与NCUG-SGA 组相比，差异有统计学意义（P=0.008）（见图2），提示2 组间的肠道菌群组成差异明显。

图2 2 组基于未加权UniFrac 距离的PCoA 分析

三、2 组幼鼠肠道菌群分布情况比较

进一步对2 组小鼠肠道内各菌群的总体分布情况进行比较，共鉴定出17 个菌门，其中2 个为未分类菌门。在微生物属水平上 （见表2），LEFse（LDA Effect Size）分析共鉴定出22 种差异菌群（P＜0.05）。

四、2 组幼鼠粪便中SCFA 水平的比较

粪便样品的SCFA 水平定量分析显示，CUGSGA 组幼鼠粪便中的SCFA 各组分水平均显著高于NCUG-SGA 组（P＜0.05）（见表3）。

表1 2 组出生及4 周龄时体重和身长比较

五、菌群功能预测分析

肠道菌群功能分析结果显示，CUG-SGA 组与NCUG-SGA 组间有多种生物学途径存在差异 （P＜0.05）。相对于NCUG-SGA 组，CUG-SGA 组苯甲酸盐降解、丙酸盐代谢、丁酸盐代谢、酮体的合成和降解、维生素B1代谢、脂肪酸生物合成、丙酮酸代谢、赖氨酸的生物合成、己内酰胺降解等均上调（均P＜0.05）。

六、Simpson 指数、SCFA、IGF-1 与幼鼠体重及身长间的相关分析

Simpson 指数与幼鼠体重及身长间的相关性分析结果显示，Simpson 指数与体重 （r=0.672，P=0.033）、身长（r=0.706，P=0.022）均呈正相关。

根据Spearman 等级相关系数建立相关矩阵，探讨肠道微生物群改变与粪便代谢物SCFA 水平变化之间的关系。结果显示，有11 种菌属相对丰度与SCFA 浓度具有明显的相关性，其中有3 种菌属相对丰度与SCFA 的不同组分水平呈显著正相关，8 种菌属相对丰度与SCFA 的不同组分水平呈负相关（|r|均＞0.6,P 均＜0.05）。

表2 2 组幼鼠粪便中属水平菌群相对丰度差异分析

SCFA 与IGF-1、幼鼠体重及身长间相关性分析显示，SCFA 的组分丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸浓度与幼鼠身长、体重及IGF-1 水平间均呈显著正相关（r 均＞0.6,P 均＜0.05）。

讨 论

我国SGA 发生率较高，为6.05%～13.01%[1]，大部分SGA 患儿在2 岁内能实现CUG，但仍会有部分患儿实现不了CUG，将会导致终身矮小。SGA 患儿出生后，相较于同龄儿可能生长速度加快，逐渐回归到正常生长发育模式，即出现CUG。CUG 是SGA 儿出生后生长发育的一个特点，而其发生机制一直是SGA 研究的热点。

出生后的生长是在遗传、内分泌和营养三大因素综合作用下进行的。有研究认为，生长与肠道菌群间存在一定的关联。对比生长发育不良的儿童与健康儿童的肠道微生物发现，生长发育不良儿童的肠道菌群存在着明显的“不成熟”[3]。将这些“不成熟”微生物群移植到小鼠中，则可发现小鼠的体重也显著降低，提示肠道菌群能够引起宿主的生长受限[4]。另有研究显示，给予无菌小鼠和对照组小鼠喂养相同饲料后，发现无菌小鼠生长速度及体重的增加均显著低于对照组小鼠。这一研究结果表明，肠道菌群对于哺乳动物出生后生长是必需的，对于宿主幼年的生长起着促进作用[5]。以上研究皆表明肠道菌群与生长有密切的关联。基于这样的理论，本研究建立了SGA 大鼠幼鼠模型，分析比较CUGSGA 组与NCUG-SGA 组间的肠道菌群及其代谢产物的差异，探讨肠道菌群与SGA 幼鼠CUG 间的相关性。

一、肠道菌群及SCFA 与SGA 幼鼠CUG 相关

本研究用Simpson 指数估算CUG-SGA 组和NCUG-SGA 组幼鼠的肠道微生物多样性。Simpson指数是用来评价微生物多样性的常用指数，兼顾丰度和均匀度，该指数数值越大，表明微生物群落多样性越高。本研究结果显示，相较于NCUG-SGA组，CUG-SGA 组幼鼠肠道菌群Simpson 指数显著升高，表明其肠道微生物群落多样性高于NCUG-SGA组。同时，本研究采用PCoA 分析2 组幼鼠肠道菌群的结构特征，结果显示CUG-SGA 组与NCUGSGA 组的肠道菌群结构特征有显著不同。另外，相关分析显示，Simpson 指数与SGA 幼鼠的体重、身长均呈正相关。综合以上结果表明，CUG-SGA 组与NCUG-SGA 组幼鼠间的肠道微生物确实存在差异，肠道内微生物群与SGA 幼鼠的CUG 有关。

表3 2 组幼鼠粪便中的平均SCFA 水平（mmol/L）

为进一步探讨肠道菌群对于SGA 幼鼠CUG的影响，本研究进一步检测分析了CUG-SGA 组与NCUG-SGA 组幼鼠的肠道微生物代谢产物SCFA。SCFA 是由未消化食物中的碳水化合物经肠道微生物群发酵而成，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸，其中乙酸、丙酸和丁酸的含量最高，共同所占百分比高达95%以上[7]。饮食及肠道环境通过复杂的方式与肠道中的微生物群落相互作用，而产生的大量SCFA 会降低肠道pH 值，进而影响肠道微生物群的组成，又转而影响SCFA 的产生，可见肠道菌群与SCFA 互为影响[8]。本研究发现，CUG-SGA 组幼鼠粪便中的SCFA 水平均远高于NCUG-SGA 组。采用PICRUSt2 预测菌群代谢功能提示，CUG-SGA 组与NCUG-SGA 组间有多种生物学途径存在差异，包括丙酸盐代谢、丁酸盐代谢等，且相对于NCUG-SGA 组，CUG-SGA 组以上指标均上调，与NCUG-SGA 组SCFA 水平远低于CUGSGA 组的检测结果相符合。同时，本研究发现，SGA幼鼠粪便中的SCFA 水平与肠道菌群中11 种菌属的相对丰度间存在显著相关性，证实SCFA 水平的高低与肠道菌群的群落结构及多样性间存在密切联系。相关分析提示，SCFA 的组分丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平与SGA 幼鼠的身长、体重及血IGF-1水平间均呈显著正相关，而血IGF-1 水平与线性生长密切相关。总之，本研究结果证实，SGA 幼鼠粪便中的SCFA 水平与其CUG 间存在相关性。

二、肠道菌群在SGA 幼鼠CUG 中可能的作用机制

目前研究认为，在胎儿期和出生后早期，受“营养物质-胰岛素-IGF-1”代谢轴调控，营养为整个代谢轴的启动因素，在生长中起着主导作用[9]。营养物质通过胃肠道系统消化吸收，而肠道内存在微生物群落，其数量庞大、种类繁多，由高达500～1 000 种共约1014个微生物细胞组成，为人体细胞数总和的10 倍，所编码的基因总和也远超过了人体自身的基因数目，至少是人类基因组的150 倍[10-11]。肠道菌群与宿主间建立了复杂的互惠共生关系，在宿主的营养和物质代谢等方面起着重要作用[12]。SCFA 作为肠道菌群的主要代谢产物，充当着肠道微生物与宿主之间的中介物。SCFA 对哺乳动物的能量代谢起着积极作用，被吸收后能够作为宿主的能源，在获取营养和能量调节中发挥作用[13]。在人体中，SCFA 提供了约10%的每日热量需求[14]。本研究显示，SGA 幼鼠粪便代谢物SCFA 中的丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸与CUG 密切相关。其中，丁酸是肠道上皮细胞的主要能量来源，特别是结肠上皮细胞，其所消耗能源的70%来自丁酸[13]。研究表明，丁酸在糖脂代谢中发挥重要作用，其经门静脉被运输到肝脏，研究发现丁酸能够刺激小鼠原代肝细胞中糖异生和相关基因的表达，膳食补充丁酸可引起肠道葡萄糖生成增加[15]。丁酸也被证明可通过乙酰辅酶A代谢产生脂肪酸、胆固醇和酮体，从而为脂质生物合成提供特定的底物[16]。另外，丙酸和丁酸能够作为G 蛋白偶联受体Gpr41 和Gpr43 的配体而影响着机体的新陈代谢[17-19]。因此，SCFA 可能调节和影响了宿主的能量代谢，从而促进了SGA 的CUG。

本研究分析比较了CUG-SGA 组与NCUG-SGA组幼鼠的肠道微生物结构及多样性，在此基础上，分析2 组间的肠道微生物代谢产物SCFA 水平差异以及其与生长指标间的相关性，结果明确提示，肠道菌群与SGA 幼鼠的CUG 间具有相关性。在此基础上，笔者将进一步分析肠道菌群影响SGA 幼鼠CUG 的可能机制，为SGA 的CUG 机制提供了新研究思路。