梁 茜，陆峥菁，邵妍妍，丁秋兰，王鸿利，王学锋

(上海交通大学医学院附属瑞金医院a.检验科；b.医学基因组国家重点实验室上海血液学研究所，上海 200025）

血管性血友病 （von Willebrand disease,vWD）为血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）量或质的缺陷导致的一类最常见的遗传性出血病，其在人群中的发病率为0.1%～1.0%[1]。根据分子发病机制的不同，vWD 可分为1 型、2 型和3 型，其中2 型又可再分为2A、2B、2M 和2N 型。1 型和3 型分别为vWF 量的减少和缺乏，2 型为vWF 质的异常[2]。通常3 型和2 型vWD 患者的出血较严重，1 型患者出血较轻。vWD 患者常表现为皮肤黏膜出血、月经过多等，重型患者还可有黄体破裂出血、胃肠道出血、关节和（或）肌肉出血等症状。但是临床研究发现，vWD 患者出血异质性较大，携带相同突变的家系成员以及血浆vWF 抗原（vWF∶Ag） 和vWF 活性（vWF∶Act）水平接近的vWD 患者的出血严重程度均可不同[3]。因此，如何准确评估vWD 患者出血风险是目前临床上亟待解决的问题。凝血酶生成试验（thrombin generation test,TGT）可实时监测凝血酶的生成情况，是全面评估机体凝血状态的良好指标，可较好地评估血友病等遗传性凝血因子缺陷症患者的出血倾向。但是，关于TGT 在预测vWD 患者出血倾向中的价值目前尚无定论。本研究评估TGT 的4 个主要参数在预测vWD 患者出血倾向中的作用。

资料与方法

一、资料

收集2018 年1 月至2019 年7 月就诊于上海交通大学医学院附属瑞金医院的38 例vWD 患者，其中男性15 例，女性23 例，中位年龄为29 岁。根据出血严重程度将患者分为轻度出血组（包括8 例1 型患者）、中度出血组（14 例，包括8 例2A 型和6 例2M 型患者）和重度出血组（16 例，包括2 例2N型、6 例重型1 型和8 例3 型患者）。

另选取同期相同年龄段的5 名健康体检者作为正常对照组。

二、方法

1.标本采集和处理： 征得患者知情同意后，采集2 管0.109 mol/L 枸橼酸钠（9∶1，V∶V）抗凝的外周静脉血，立即行3 000 r/min 离心15 min（离心半径为11.5 cm），留取上2/3 层血浆；再次行3 000 r/min 离心15 min（离心半径为11.5 cm），取上2/3 层血浆，制备乏血小板血浆 （platelet-poor plasma，PPP），于-80 ℃下冻存。

2.vWD 诊断和分型试验： 活化部分凝血活酶时间 （activated partial thromboplastin time,APTT）、vWF∶Ag、vWF∶Act、凝血因子Ⅷ活性（FⅧ∶C）等检测中所用试剂为美国Instrumentation Laboratory 公司产品，仪器为美国ACL TOP 全自动血凝分析仪，严格按照说明书进行操作。vWF 多聚体分析采用琼脂糖凝胶电泳，vWF 与胶原结合能力（vWF∶CB）、vWF与FⅧ结合能力（vWF∶FⅧB）分别采用酶联免疫吸附试验和发色底物法检测。

3.TGT： 用Fluoroskan Ascent FL 荧光检测仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），通过自动校正凝血酶曲线法（calibrated automated thrombogram,CAT）检测凝血酶的生成量（激发光波长为390 nm，发射光波长为460 nm）。激活剂有低浓度组织因子（tissue factor,TF）（含1 pmol/L TF 和4 μmol/L 磷脂）和高浓度TF（含5 pmol/L TF 和4 μmol/L 磷脂）2 种，均购自法国Stago 公司。在荧光检测仪的检测孔中加入80 μL 的PPP 和20 μL 激活剂（1 pmol/L TF 激活或5 pmol/L TF 激活），校正孔中加入80 μL 的PPP 和20 μL 凝血酶定标品。上机后，仪器自动向每孔内加入20 μL FluCa 荧光底物。使用Thrombinoscope 软件动态检测凝血酶生成量。实验操作严格按照试剂说明书要求进行。凝血酶生成曲线主要参数有以下4 个，①延迟时间（lag time，LT），即从反应开始到凝血酶开始生成所需时间；②凝血酶生成峰值（以下简称峰值），为凝血酶生成的最大量；③达峰时间（time to peak，ttPeak），即从反应开始到凝血酶生成达到最大量所经历的时间；④凝血酶生成潜力（endogenous thrombin potential，ETP），凝血酶生成曲线下的积分面积，反映了每分钟凝血酶生成的量。

4.统计学处理： 采用统计学分析软件Graph-Pad Prism（5.0 版本，美国）进行相关统计分析。采用单因素方差分析比较TGT 参数在正常对照者与轻、中、重度出血患者间的差异，同时采用Tukey 检验对各组间进行两两比较。采用Spearman 相关分析评估患者TGT 各参数与vWF∶Ag、vWF∶Act、FⅧ∶C 间的相关性。

结 果

一、各组vWD 患者及正常对照者的血浆表型检测结果

轻度出血组患者的vWF∶Ag、vWF∶Act 和FⅧ∶C水平分别为43.5%±9.3%、40.0%±9.5%和56.6%±9.4%；中度出血组患者的vWF∶Ag、vWF∶Act 和F Ⅷ∶C 水 平 分 别 为21.7%±6.9%、6.7%±5.7%和41.7%±10.7%；重度出血组患者的vWF∶Ag、vWF∶Act和FⅧ∶C 水平分别为11.3%±30.7%、10.5%±29.2%和9.6%±8.9%；正常对照组的vWF∶Ag、vWF∶Act 和FⅧ∶C 水平分别为127.5%±29.5%、108.5%±24.4%和126.3%±28.8%。

二、各组vWD 患者及正常对照者的TGT 检测结果比较

各组vWD 患者在1 pmol/L TF 和5 pmol/L TF激活下TGT 参数的均值见表1。在1 pmol/L TF 激活下，TGT 各参数在正常对照组与vWD 组以及不同出血程度组间的差异较5 pmol/L TF 激活下更明显。在1 pmol/L TF 激活下，重度出血组的ETP 显著低于正常对照组、轻度出血组及中度出血组（P 均＜0.000 1）；正常对照组的峰值显著高于轻度出血组、中度出血组和重度出血组（P 均＜0.05）；重度出血组的峰值显著低于轻度出血组和中度出血组 （P 均＜0.001）；重度出血组的ttPeak 显著长于正常对照组、轻度出血组和中度出血组（P＜0.001）（见图1）。在5 pmol/L TF 激活下，ETP、ttPeak 值在各组间差异无统计学意义（P＞0.05），仅峰值在重度出血组与正常对照组、轻度出血组、中度出血组间，以及在正常对照组与中度出血组间差异有统计学意义（P 均＜0.05）（见图2）。各组间参数LT 在1 pmol/L 和5 pmol/L TF 激活下的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 vWD 各组及正常对照组在1 pmol/L TF 激活下TGT参数的组间差异分析

图2 vWD 各组及正常对照组在5 pmol/L TF 激活下TGT参数的组间差异分析

三、vWD 患者血浆表型检测指标与TGT 参数间的相关性分析

在相关性分析中，在1 pmol/L TF 激活下的峰值与患者FⅧ∶C 间的相关性最好，（相关系数R2为0.65），在5 pmol/L TF 激活下的峰值与患者FⅧ∶C间的相关系数R2为0.42。在1 pmol/L、5 pmol/L TF 激活下，ETP、ttPeak 值与患者血浆各表型指标（vWF∶Ag、vWF∶Act）间的相关性均较弱（R2＜0.5），LT 与患者各指标间均不相关。

表1 各组vWD 患者及正常对照组TGT 检测结果（ ）

表1 各组vWD 患者及正常对照组TGT 检测结果（ ）

讨 论

常规凝血功能筛查试验（如APTT 检测）适用于筛查内源性凝血因子缺陷，对1 型vWD 患者的诊断不灵敏，其仅反映血液凝固过程的早期阶段，当凝固法测试达到凝固终点时，凝固反应所需要产生的凝血酶仅占总凝血酶的10%。因此，无法全面体现个体的低凝或高凝状态。TGT 不仅可以检测生成的凝血酶含量，还可反映凝血酶活性状态的持续时间，可提供更全面的功能评价，已较广泛地被应用于评估遗传性凝血因子缺陷症患者的出血倾向以及易栓症患者体内的高凝状态[4-6]，还可用于抑制物阳性血友病患者的治疗监测[7]。但是，TGT 在vWD 患者中的应用却鲜有报道。虽然vWF 不直接参与血浆凝血酶生成，但其主要生理功能之一是作为FⅧ的保护性载体而参与二期止血。因此，本研究拟分析不同TF 浓度激活下vWD 患者的TGT 参数，来评估TGT 在预测vWD 患者出血倾向中的作用。

在1 pmol/L TF 激活下，正常对照组的峰值显著高于轻度出血组、中度出血组及重度出血组，重度出血组的峰值显著低于轻度出血组及中型出血组，ETP、ttPeak 值仅在重度出血组与正常对照组、轻度出血组、中度出血组间的差异有统计学意义，而LT 值在各组间均无差异，其在5 pmol/L TF 激活下也有类似表现，提示峰值是TGT 的4 个主要参数中评估vWD 患者出血倾向的最佳指标。本研究结果显示，在1 pmol/L TF 激活下，TGT 的峰值可较好地反映患者组与正常对照组以及不同程度出血组间的差异。该结果与Rugeri 等[3]的研究结果接近。但Quiroga 等[8]对以黏膜出血为主要临床表现的遗传性出血病患者PPP 样本的TGT 检测结果显示，1 型vWD 患者、血小板功能缺陷症患者与正常人间的TGT 参数差异均无统计学意义[8]，其原因可能与患者群体以及TGT 试剂成分有关。Quiroga 等[8]的研究纳入1 型vWD 患者共45 例，患者vWF∶Ag、vWF∶Act 以及FⅧ∶C 的均值分别为34.6%±15.3%、29.8%±15.4%和53.4%±26.5%，而本研究中纳入1 型患者8 例，患者vWF∶Ag、vWF∶Act 以及FⅧ∶C的 均 值 分 别 为43.5%±9.3%%、40.0%±9.5% 和56.6%±9.4%，可能因本研究中患者例数较少，患者间表型差异（SD 值）较小。此外，既往研究表明，TGT试剂（TF 和磷脂的浓度及来源）与其检测结果密切相关，低浓度TF 激活下的TGT 往往比高浓度TF激活的TGT 更易体现患者的出血倾向[5,9]，其原因可能是，在低浓度TF 激活下，凝血酶生成速率较慢，更易体现内源性途径激活的凝血功能缺陷。本研究结果同样显示，1 pmol/L TF 激活下的TGT 较5 pmol/L TF 激活更易体现患者组与正常对照组之间的差异。Quiroga 等[8]的研究中使用的TF 及磷脂均低于本研究（TF 及磷脂的浓度分别为0.17 pmol/L 和0.8 μmol/L），而本研究中使用的TGT试剂为Stago 公司的商品化试剂盒，Quiroga 等[8]的研究所使用的TF 和磷脂购自美国Avanti Polar Lipids 公司，试剂来源的不同，可能也是2 项研究结果间存在差异的原因之一。

在生理情况下，血浆中的vWF 除了作为FⅧ的保护性载体参与二期止血，还可介导血小板的黏附和聚集而参与一期止血，此外，vWF 生理功能的发挥还需血流剪切力的作用。本研究使用的样本为PPP，且检测体系为静止状态，因此可能无法全面体现vWF 在体内的促凝功能。富血小板血浆内含有血小板，不仅可体现vWF 一期止血功能（介导血小板黏附和聚集），血小板内还储存部分vWF 蛋白，因此采用富血小板血浆标本检测TGT 更接近体内的生理状态[10]。一项对3 型vWD 患者（9 例）的TGT检测显示，患者PPP 的峰值显著降低（降至正常的16%），但富血小板血浆的峰值却轻微下降（降至正常的77%），提示血小板对3 型vWD 患者血浆的凝血酶生成有一定补偿作用[9]。然而，富血小板血浆标本的前处理复杂（需经2 次低速离心，并要避免血小板活化），批间差异较大，且标本无法冻存。

总之，1 pmol/L TF 激活下TGT 的峰值可较好地反映不同vWD 患者的出血倾向，而富血小板血浆标本是否更适合评估vWD 患者的凝血酶生成能力，需要在后续研究中进一步证实。