洪 杨，胡 沁，李晓静，马恩兰，郭欣欣，侯英勇，宿杰·阿克苏

子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，其病死率较高[1-2]，流行病学研究显示人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)存在于99%的子宫颈癌中[3]，子宫颈癌的发病时间较长，从癌前病变开始可达10～30年[4]。早发现、早诊断、早治疗是预防子宫颈癌发生、发展的重要手段。市场上HPV的检测方法原理及特点均有所不同，其中获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准的方法仅有4种：Digene HC2 HPV HR test、Cervista HPV HR test、Cobas 4800 HPV test、Aptima HPV[5]。由于其检测HPV操作步骤多而繁琐、检测成本高、不能具体分型每一种感染HPV型别等缺点，限制了其在临床常规检测中的广泛应用。不同HPV高危亚型在各类人群中的致癌能力是否不同，使HPV分型检测得到越来越多关注。本实验比较的qRT-PCR法、反向斑点杂交法和流式荧光法均经FDA批准，是国内现有较常见的HPV分型检测平台，通过比较不同HPV检测平台特点及结果的差异性，为临床选择HPV检测方法提供参考依据。

1.1 材料收集2018年5月复旦大学附属中山医院行HPV检测的800例子宫颈细胞标本，年龄20～68岁，使用无菌细胞学采样刷，顺时针旋转3～5周刷取子宫颈鳞柱交界处脱落细胞，将收集的细胞保存于ThinPrep细胞保存液(HOLOGIC，美国)中。

1.2 HPV检测将所有送检标本先留取4 mL用于不同平台HPV对比实验，其余标本进行液基细胞学检测。

1.2.1qRT-PCR 留取的4 mL样本中的1 mL均先用qRT-PCR试剂盒(上海之江生物公司)对15种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)进行分型检测，操作方法严格按说明书进行，结果判断：以循环阈值(Ct值)来标记病毒负荷量，Ct值按如下公式计算，Ct=Ct标本-Ct内参照+28，其中内参照为人单拷贝基因MNBH；若Ct≤38.0且扩增曲线呈典型的S型，则判定为HPV阳性。所有的阳性病例(68例)和简单随机抽样法抽取的阴性病例(22例)再用流式荧光法分型检测试剂盒(上海透景公司)和反向斑点杂交法分型检测试剂盒(北京博晖公司)进行检测。

1.2.2反向斑点杂交法 留取的4 mL样本中的1 mL对18种高危型HPV(前15种加53、73、83)和6种低危型HPV(6、11、42、43、44、81)进行分型检测，操作方法严格按说明书进行，结果判断：杂交膜的SP点(3个)均有阳性斑点，内参质控点(3个)有阳性斑点，且有HPV探针阳性斑点出现，提示样本为该探针对应亚型阳性。

1.2.3流式荧光法 留取的4 mL样本中的1 mL对17种高危型HPV(前15种加53、26)和10种低危型(前6种加40、83、55、61)进行分型检测，操作方法严格按说明书进行，结果判断：阳性内对照Globin的信号﹥150，任何HPV型别特异性探针的信号﹥150则判定该探针对应的型别为阳性。

1.3 HPV基因测序三种HPV检测平台结果不一致时，则对样本进行HPV DNA的一代测序。样本来源于留取的4 mL样本中的1 mL。测序工作委托上海之江生物公司采用3730XL测序仪(ABI，美国)进行。

1.4 液基细胞学检测所有病例均进行液基细胞学检测，本实验获得的液基细胞学结果报告采用TBS分级报告系统。

1.5 统计学分析使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计算每种HPV型别检测结果的Kappa指数(Kappa index, KI)，KI≥0.75定义为一致性极好，0.4

2 结果

2.1 不同HPV型别感染率的比较以一代测序结果为参照，统计标本15种高危型HPV的感染率，感染率为7.125%(57/800)，感染率型别前三的分别为HPV 52、16、58型(图1)。

图1 高危型HPV阳性标本型别及对应感染率

2.2 每种型别HPV检测结果的一致性比较qRT-PCR与反向斑点杂交法结果一致性良好及以上为100%；qRT-PCR与流式荧光法结果一致性良好及以上为86.7%；流式荧光法与反向斑点杂交法结果一致性良好及以上为80%(表1)。

表1 三种平台两两比较15种高危型HPV检测结果一致性KI值

2.3 三种平台HPV检测结果与一代测序结果符合率比较由于有10例Ct值>36的样本测序失败，以一代测序结果作为参照，比较其余80例三种平台检测结果的符合率(表2)。qRT-PCR、反向斑点杂交法、流式荧光法的符合率分别为87.78%、94.45%、74.44%。qRT-PCR与反向斑点杂交法结果差异无统计学意义(P>0.05)，流式荧光法与qRT-PCR、反向斑点杂交法结果差异均有统计学意义(P<0.05)。结果表明：反向斑点杂交法和qRT-PCR法与一代测序结果符合率较高，qRT-PCR和反向斑点杂交法的灵敏度分别为96.6%和91.6%。

表2 三种平台两两比较15种高危型HPV检测结果符合率

3 讨论

本文通过对15种高危型HPV感染率的统计得出，感染率前三位的分别是HPV 52、16、58型，与文献报道[6]的结果基本一致。高危型HPV分型检测在子宫颈癌及其癌前病变的筛查中具有指导意义[7]。本组通过对不同的HPV检测平台所得检测结果进行比较与分析，为探究最为准确、灵敏的检测方法提供了依据，结果显示：(1)qRT-PCR法和反向斑点杂交法的结果一致性最高，这与文献[8-9]报道一致；(2)qRT-PCR法的灵敏性最高，反向斑点杂交法与一代测序结果符合率最高。这可能由以下两方面原因所致：(1)一代测序的敏感度适中，低浓度的病毒载量无法检出；(2)qRT-PCR法具有极高的灵敏性使得含量极低的靶基因亦可被检测，而反向斑点杂交法敏感度适中，且一体成型不易交叉污染。比较三种平台检测特点，qRT-PCR法具有灵敏性高，操作简单，用时较短的特点，可对病毒负载量进行检测，但受荧光通道的限制只能检测15种高危型HPV。反向斑点杂交法具有操作简单，特异性高，且实验环境不受PCR实验室分区限制的优点，检测结果定性不能定量。流式荧光法检测的原理是利用微球-探针-PCR产物-生物素-链霉亲和素-藻红蛋白复合物的紧密结合，其检测的HPV型别种类最多，通量大，但同时操作步骤多，易引入人为误差，检测结果定性不能定量，本实验结果显示其检测结果和一代测序符合率仅74.44%，与qRT-PCR、反向斑点杂交法检测结果的差异有统计学意义，原因可能因影响结合率的因素较多，使得无法保证百分之百的结合而影响检测结果。三种检测方法的实验原理、引物、酶均不同，其检测HPV基因型别有所不同，不同的引物探针对之间可能存在相互干扰，造成检测结果存在一定的差异。

本实验发现10例qRT-PCR检测结果Ct值﹥36，而另两种检测平台和一代测序均未测出，而液基细胞学结果均为轻～中度炎症，说明HPV敏感性过高可能并不具有很高的特异性，因此子宫颈癌的筛查方法并不推荐最敏感的方法。已有研究显示仅有单独HPV检测的筛查增加了阳性结果和阴道镜检查的数量，而长期预后尚不确定[10]。研究表明，液基细胞学联合高危型HPV检测可显著提高子宫颈癌病变的阳性检出率及特异性，减少过度治疗的可能性[11]。本课题中组织学检测病例样本量相对较少，但入选病例为800例，样本量相对较大，且三个不同平台重复实验，检测结果互相验证，所得结论与文献报道一致，进一步证明结果的准确性。

综上所述，qRT-PCR法和反向斑点杂交法的结果一致性最高，在临床应用上各有优缺点，液基细胞学联合高危型HPV检测可显著提高子宫颈癌病变的阳性检出率及特异性。今后的工作中可以结合病理组织活检结果，扩大研究规模，并开展具有长期随访结果的前瞻性研究。