陈秀慧，曲军英，林 瑶，陈秀玲

子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，美国每年新发病例超10 000例，死亡病例超4 000例[1]。在部分发达国家，由于筛查和治疗水平的提高，子宫颈癌的发病率和病死率有所改善，但在某些非洲和亚洲国家的情况却不容乐观，2015年发布的中国癌症统计报告显示，子宫颈癌的发病率和病死率逐年增加，34～44岁女性中子宫颈癌的发病率排名位居第二，严重威胁我国女性的生命健康[2]。近年来，尽管放疗、化疗和外科手术等治疗手段不断进步，但子宫颈癌患者的5年生存率仍然不足50%[3]，因此探索子宫颈癌新的治疗手段仍是重要问题。与肝细胞癌预后不良相关长链非编码RNA(associated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma long non-coding RNA, lncRNA AWPPH)是新近发现的致癌长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)，其与肝癌、胃癌和骨肉瘤等肿瘤的增殖和侵袭恶性生物学行为密切相关[4-6]，但lncRNA AWPPH在子宫颈癌中的作用尚不清楚。miR-203a表达异常可导致恶性肿瘤的发生[7-8]，在子宫颈癌中miR-203a-5p作为lncRNA WT1-AS的直接靶标，可调节子宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭[9]，但miR-203a在子宫颈癌中的表达尚未见相关报道。文献报道胃癌中miR-203a与lncRNA AWPPH具有结合位点[5]。本文通过观察lncRNA AWPPH和miR-203a在子宫颈癌中表达，初步探讨lncRNA AWPPH和miR-203a调控子宫颈癌发生、发展的可能机制。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集2011年7月～2015年6月上海中医药大学附属曙光医院诊治的子宫颈癌75例。患者年龄(56.24±10.51)岁，>50岁者48例，≤50岁者27例；其中鳞癌40例，腺癌35例；按照国际妇产科协会(FIGO)和国际妇科肿瘤协会(IGCS)共同制定的《妇科恶性肿瘤分期及临床实践指南》[10]标准：Ⅰa期26例，Ⅰb期16例，Ⅰc期14例，Ⅱa期12例，Ⅱb期7例；分化程度：中+高分化55例，低分化20例；无肌层浸润38例，有肌层浸润37例；无淋巴结转移42例，有淋巴结转移33例。另收集同期我院行子宫全切手术患者的正常子宫颈上皮组织样本40例，患者年龄(54.61±12.63)岁，与子宫颈癌患者年龄差异无统计学意义(P>0.05)。本实验经我院医学伦理委员会审核通过，患者及家属均知情同意，并签署知情同意书。入组标准：(1)患者均为初次治疗；(2)标本在我院行穿刺或手术获得，并经病理专家确诊为子宫颈癌组织；(3)未接受过抗肿瘤治疗；(4)临床资料和随访资料完整；(5)未发生远处器官转移；(6)无个人肿瘤病史；(7)未合并心、肝、肾及肺功能障碍。

1.2 实验试剂与仪器总RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，氯仿、异丙醇以及无水乙醇等相关试剂购自济南萧试化工公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；OneStep RT-PCR Kit试剂盒购自德国QIAGEN公司；lncRNA AWPPH、miR-203a和内参U6引物由上海生工公司合成；Nanodrop2000核酸测定仪购自美国Thermo公司；qRT-PCR仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3 RNA抽提和qRT-PCR取100 mg新鲜组织剪碎后在研钵中进行研磨，加入1 mL Trizol试剂完全裂解组织后移至EP管中，加入200 μL氯仿混匀后超低温冰箱离心30 min，吸取500 μL水相层溶液与500 μL异丙醇混匀后超低温冰箱离心15 min，无水乙醇洗涤2次，无RNA酶水溶解RNA，测得RNA浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书步骤将总RNA合成为cDNA。以cDNA为模板，按照SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒说明书配制qRT-PCR反应体系，cDNA模板1 μL、ddH2O 3 μL、上下游引物各0.4 μL、SYBR Premix EX TaqⅡ10 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL，总体积10 μL。于qRT-PCR仪上机进行扩增反应：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃，30 s，合计40个循环，并获得各样品的循环阈值(cycle threshold, Ct)。以U6基因为内参，用2-ΔΔCt公式计算lncRNA AWPPH和miR-203a的相对表达量。lncRNA AWPPH上游引物5′-CTGGAT GGTCGCTGCTTTTTA-3′，下游引物5′-AGGGGGAT GAGTCGTGATTT-3′；miR-203a上游引物5′-CCGGT GAAATGTTTAGGACCACTAG-3′，下游引物5′-GCC GCGTGAAATGTTTAGG-3′；内参U6上游引物5′-GATTCCTATGTGGGCGACGAG-3′，下游引物5′-CC ATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′。

1.4 随访患者术后每隔3个月随访1次，通过电话或门诊询问方式进行随访，随访时间为患者死亡或截止到2018年1月。其中，随访时间最长为70个月，最短为21个月。

2 结果

2.1 子宫颈组织中lncRNA AWPPH和miR-203a的表达采用qRT-PCR检测lncRNA AWPPH、miR-203a在75例子宫颈癌组织和40例正常子宫颈组织中的表达水平。结果显示：lncRNA AWPPH在子宫颈癌组织中的表达水平(1.81±0.87)高于正常子宫颈组织(1.00±0.46)(t=5.486，P<0.001，图1A)，提示lncRNA AWPPH表达增多可能与子宫颈癌的发生相关。miR-203a在子宫颈癌组织中的表达(0.77±0.43)低于正常子宫颈组织(1.00±0.39)(t=2.820，P=0.006，图1B)，提示miR-203a表达降低可能与子宫颈癌的发生相关。

图1 子宫颈癌组织中lncRNA AWPPH(A)和miR-203a(B)的表达

2.2 子宫颈癌中lncRNA AWPPH、miR-203a表达与临床病理特征的关系子宫颈癌组织中，lncRNA AWPPH表达与患者年龄、组织类型、分化程度和肌层浸润均无关(P>0.05)，与临床分期和淋巴结转移呈正相关(P<0.05)；miR-203a表达与患者年龄、组织类型和肌层浸润均无关(P>0.05)，与临床分期、分化程度和淋巴结转移呈负相关(P<0.05，表1)。

表1 子宫颈癌组织中lncRNA AWPPH和miR-203a表达及与临床病理特征的关系

2.3 子宫颈癌中lncRNA AWPPH、miR-203a表达对患者预后的影响绘制Kaplan-Meier生存曲线，采用Log-rank检验分析lncRNA AWPPH和miR-203a表达对子宫颈癌患者预后的影响。根据lncRNA AWPPH在子宫颈癌中的表达水平分为lncRNA AWPPH高表达组(≥1.81，42例)和lncRNA AWPPH低表达组(<1.81，33例)，lncRNA AWPPH高表达患者的预后比lncRNA AWPPH低表达患者差(Log-rank χ2=4.61，P=0.032，图2A)。根据miR-203a在子宫颈癌组织中的表达水平分为miR-203a高表达组(≥0.77,36例)和miR-203a低表达组(<0.77,39例)，miR-203a低表达患者的预后比miR-203a高表达患者差(Log-rank χ2=5.58，P=0.018，图2B，表2)。

表2 子宫颈癌中lncRNA AWPPH、miR-203a表达与患者预后的关系

图2 lncRNA AWPPH(A)和miR-203a(B)表达对子宫颈癌患者预后(全因死亡)的影响

2.4 Cox多因素分析影响子宫颈癌患者预后的因素建立Cox比例风险回归模型，以本实验资料为样本，以预后状况为应变量，赋值1=死亡，0=生存，t=生存期。自变量选择了临床分期、分化程度、淋巴结转移、lncRNA AWPPH表达、miR-203a表达等5个指标。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。回归结果显示：lncRNA AWPPH高表达(P=0.007)、miR-203a低表达(P=0.014)均是影响子宫颈癌患者预后不良的显著影响因素(表3)。

表3 Cox多因素分析影响子宫颈癌患者预后不良的独立危险因素

2.5 子宫颈癌中lncRNA AWPPH和miR-203a表达的相关性Pearson相关性分析子宫颈癌组织中lncRNA AWPPH与miR-203a的表达相关性，结果显示lncRNA AWPPH与miR-203a表达呈负相关(P=0.001，表4)。

表4 子宫颈癌中lncRNA AWPPH和miR-203a表达的关系

3 讨论

目前子宫颈癌的治疗手段并不能改善患者的预后，但在分子水平上已经发现了针对致癌分子的特殊药物，这些药物不仅可以特异性抑制肿瘤的进展，还可以避免化疗和放疗等治疗产生的毒副反应，同时随着分子生物学的研究进展，子宫颈癌的靶向治疗取得了显著进展，抗血管生成、免疫检查点抑制剂和表皮生长因子受体阻断剂等靶向药物也不断出现[11]。新兴证据表明，lncRNA在包括肿瘤在内的各种人类疾病中发挥着重要作用，lncRNA是一组没有蛋白质编码潜能的长度大于200个核苷酸的大转录本，其可以通过调控靶标参与细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和化疗耐药性等多种病理生理过程，可能是肿瘤治疗的潜在靶标[12-13]。

越来越多的lncRNA被发现，其中lncRNA AWPPH是由Zhao等[4]采用数据库和qRT-PCR在肝细胞癌中鉴定新型lncRNA，其在肝细胞癌组织中呈高表达，与包囊不完全、微血管浸润和TNM晚期有关，并且lncRNA AWPPH高表达是预后不良的独立预后因素，因此其被命名为与肝细胞癌预后相关的lncRNA。近年来lncRNA AWPPH在其他恶性肿瘤中的作用也逐渐被发现，在骨肉瘤组织和细胞中lncRNA AWPPH高表达，并且其可以促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和抑制细胞凋亡[6]。lncRNA AWPPH在三阴型乳腺癌血浆中高表达，从而能够促进肿瘤细胞增殖和降低细胞对卡铂治疗的敏感性[14]。本实验中qRT-PCR检测结果发现，与正常子宫颈组织相比，lncRNA AWPPH在子宫颈癌组织中表达上调，且lncRNA AWPPH表达与子宫颈癌患者临床分期、淋巴结转移和预后不良相关。Li等[15]报道发现，骨肉瘤组织中lncRNA AWPPH高表达与患者晚期、肿瘤大小、转移和低生存率有关；Huo等[16]的报道也显示，lncRNA AWPPH高表达非小细胞肺癌患者的生存时间明显缩短，并且其与局部和远处复发相关，与本实验结果相似。

RNA转录物中包含共享miRNA的响应元件，miRNA通过共享响应元件相互连接发挥功能，即miRNA可作为竞争内源性RNA(ceRNA)发挥功能。越来越多的证据表明，lncRNA可以作为内源性miRNA的ceRNA来调节靶标[12-13]。Li等[5]报道显示，胃癌中miR-203a与lncRNA AWPPH具有结合位点，lncRNA AWPPH为miR-203a的ceRNA，两者表达相反。本实验中Pearson等级相关性分析显示子宫颈癌中lncRNA AWPPH和miR-203a两者的表达呈负相关性，表明在子宫颈癌中lncRNA AWPPH可能作为ceRNA负调控miR-203a的表达。miR-203a在多种肿瘤中表达异常，但在不同肿瘤中其发挥的作用并不相同，有报道结肠癌组织中miR-203a表达上调，其可以促进结直肠癌细胞的增殖、集落形成以及迁移和侵袭[7]；miR-203a在卵巢癌组织中表达下调，且与FIGO分期、分级和预后有关，过表达miR-203a能够抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡和阻滞细胞周期[8]。本实验qRT-PCR检测结果发现与正常子宫颈组织相比，miR-203a在子宫颈癌组织中表达降低，且miR-203a表达与子宫颈癌患者临床分期、分化程度、淋巴结转移和预后不良相关，这与miR-203a在卵巢癌中的研究结果具有一致性，表明miR-203a在子宫颈癌中发挥抑癌基因的作用，提示lncRNA AWPPH可能作为miR-203a的ceRNA促进子宫颈癌的恶性进展，但两者的具体调控作用仍需后续深入研究。

另外本实验采用Cox多因素回归分析发现lncRNA AWPPH高表达和miR-203a低表达是影响子宫颈癌患者预后不良的独立危险因素，表明lncRNA AWPPH和miR-203a可能是子宫颈癌患者的潜在治疗靶点和预后分子，且lncRNA AWPPH可能作为miR-203a的ceRNA促进子宫颈癌的进展，但具体的机制仍需在细胞水平中进行后续研究。

综上所述，子宫颈癌中lncRNA AWPPH呈高表达，miR-203a呈低表达，两者均与患者不良病理参数和预后相关，两者可能是子宫颈癌不良预后的独立危险因子和治疗候选靶标。