赵顺鑫，周 浓,，杨琳琳，魏祖晨，谷文超，陈妍斌，陈群辉，吴应梅*

(1. 重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 404120； 2. 大理大学 药学与化学学院，大理 671000)

浙贝母为百合科植物浙贝母(FritillariathunbergiiMiq.)的干燥鳞茎，具有清热化痰止咳，解毒散结消痈的功效，可用于风热咳嗽，痰火咳嗽，肺痈，乳痈，瘰疬，疮毒的治疗[1]。有研究表明浙贝母提取物可对H1N1流感病毒发挥抗病毒作用，具有作为新型候选治疗药物或抗流感剂的潜在用途[2]。化学研究表明浙贝母的主要活性成分是生物碱、皂苷类、水溶性成分等[3-4]，而水溶性成分主要为核苷类化合物[5]，是贝母质量控制与检测的主要指标之一[6-7]。浙贝母的产地较多，在现有的研究中有学者以生物碱为检测标准对浙贝母的地理差异性进行了研究[8]，但以核苷类成分为检测标准的地理差异性研究较少。因此，本试验采用高效液相色谱法对不同产地浙贝母药材中10种水溶性核苷类成分进行分析，并对比不同产地栽培前后核苷类化合物的含量变化，以期为浙贝母的质量控制及浙贝母药材的栽培和开发利用提供一定的理论依据和数据支撑。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪(LC-20A，日本岛津公司)；超声波清洗机(SB-5200DTN，宁波新芝生物科技股份有限公司)；多管架自动平衡离心机(TDZ5-WS，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)；万分之一分析天平(CP225D，德国Sartorius公司)。

1.2 试验药材与试剂

浙贝母样品来源于浙江省磐安县、浙江省宁波市、江苏省南通市和重庆市奉节县4个种植基地，经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为百合科植物浙贝母(FritillariathunbergiiMiq.)的干燥鳞茎(见表1)。

表1 样品来源Table 1 Samples source

对照品尿嘧啶(CAS: 66-22-8)、胞苷(CAS: 65-46-3)、鸟嘌呤(CAS: 73-40-5)、鸟苷(CAS: 118-00-3)、腺嘌呤(CAS: 73-24-5)、尿苷(CAS: 58-96-8)、脱氧肌苷(CAS: 890-38-0)、脱氧胸苷(CAS: 50-89-5)、腺苷(CAS: 58-61-7)和脱氧腺苷(CAS: 16373-93-6)购自南京都莱生物技术有限公司，纯度经HPLC峰面积归一化法计算大于98%。甲醇为德国默克公司生产的色谱纯甲醇，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Venusil MP C18(2)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A(水)-B(甲醇)梯度洗脱：0～15 min(B 1%～5%)；15～20 min(B 5%～15%)；20～25 min(B 15%～20%)；25～33 min(B 20%～28%)。检测波长：260 nm；体积流量：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：30℃。按照上述色谱条件进行分析，各成分分离度良好，混合对照品和浙贝母药材(S2)色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)及样品(B)的HPLC图谱Fig.1 The Chromatogram of reference substances (A) and Sample (B)注：1 尿嘧啶；2 胞苷；3 鸟嘌呤；4 鸟苷；5 腺嘌呤；6 尿苷；7 脱氧肌苷；8 脱氧胸苷；9 腺苷；10 脱氧腺苷

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取减压干燥至恒重的尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧胸苷、腺苷、脱氧腺苷对照品适量，加蒸馏水溶解制成质量浓度分别为0.532、0.768、0.174、0.844、0.575、0.570、0.643、0.485、0.564、0.512 mg·mL-1的对照品贮备液。

2.3 样品溶液的制备

精密称取浙贝母粉末(过50目筛)1.0 g，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加20%甲醇10 mL，混匀，室温下超声提取30 min(超声功率300 W，工作频率40 kHz)，取出，放至室温，摇匀，倒入离心管中，4 000 r·min-1离心10 min，过滤，滤渣重复上述操作1次，合并滤液，以20%甲醇定容至25 mL容量瓶中，上机前4 000 r·min-1离心10 min后用0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4 标准曲线的绘制

分别取2.2项下各对照品贮备液适量，加蒸馏水定容至10 mL制成混合对照品溶液，尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧胸苷、腺苷、脱氧腺苷的质量浓度分别为26.600、57.600、13.050、50.640、25.875、34.200、67.515、43.650、59.220、30.720 μg·mL-1。并逐级稀释，得到一系列不同质量浓度的10种核苷混合对照品溶液，置于4℃的冰箱内，临用前以0.22 μm微孔滤膜滤过，供分析用。分别在2.1项下方法进行测定，以各对照品的峰面积积分值(y)与其相应的质量浓度(x)进行线性回归，得回归方程、相关系数和线性范围，结果见表2。

表2 对照品的线性关系和范围Table 2 Linearities and ranges of ten reference substances

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验

取2.4项下混合对照品溶液，按2.1项下方法连续进样6次，记录各核苷的色谱峰面积，通过计算RSD以考察仪器的精密度。结果尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧胸苷、腺苷、脱氧腺苷峰面积的RSD分别是0.22%，0.74%，1.74%，0.18%，0.12%，0.20%，0.86%，0.12%，0.44%，0.28%，表明本方法精密度良好。

2.5.2 重复性实验

取同一浙贝母样品6份(S1)，每份精密称定1.0 g，按照2.3项方法平行制备样品溶液，按照2.1项色谱条件进行分析，记录各核苷的色谱峰面积，通过计算RSD以考察本方法的重复性。结果尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧胸苷、腺苷、脱氧腺苷峰面积的RSD分别是1.22%，2.46%，1.99%，1.46%，1.54%，2.54%，2.23%，2.21%，1.97%，2.35%，表明样品制备方法重复性良好。

2.5.3 稳定性实验

将制成的样品溶液(S2)在室温条件下密闭放置，分别在0、3、6、9、12、24 h进样6次，记录各核苷的色谱峰面积，通过计算RSD以考察本样品的稳定性。结果尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧胸苷、腺苷、脱氧腺苷峰面积的RSD分别是1.43%，2.31%，2.68%，2.36%，2.71%，1.21%，1.35%，1.69%，2.70%，2.44%，表明样品溶液9 h内稳定性良好。

2.5.4 加样回收试验

精密称取已知含量的浙贝母粉末0.5 g(S2)，共6份，分别精密依次加入2.2项下各核苷对照品贮备溶液适量，按2.3项下方法制备样品溶液，在2.1项色谱条件下进行上机检测，计算各成分的加样回收率和RSD，用于验证本方法的准确性，计算加样回收率，结果见表3。结果表明，浙贝母(S2)中10种核苷的平均回收率在97.52%～102.99%，RSD范围为1.35%～2.41%，符合分析要求。表明上述实验方法的准确度较高，能应用于浙贝母中核苷类活性成分的检测与分析。

表3 浙贝母中10种核苷类成分的加样回收率试验(n=6)Table 3 Recovery test of 10 nucleoside components in F. thunbergii Miq.

2.6 样品含量测定

按2.3项下方法制备8批供试品溶液，每组平行准备3份，按2.1项下方法进行测定，测定浙贝母中10种核苷类化合物的含量。不同样品中核苷类成分含量结果见表4。结果表明：不同产地浙贝母中10种核苷类成分含量差异显著，每个样品10种核苷类成分结构比(每个核苷类成分所占该样品核苷类成分总量比值)不相同。4个产地的浙贝母中尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、鸟苷、腺嘌呤、尿苷、脱氧肌苷、脱氧胸苷、腺苷、脱氧腺苷和核苷总平均含量分别为120.593、134.784、90.914、244.528、80.545、383.489、320.191、119.870、275.248、73.203、1843.365 μg·g-1。其中，尿苷含量最高，平均含量达383.489 μg·g-1，鸟苷、尿苷、脱氧肌苷和腺苷的平均含量占10种核苷类化合物平均总量的66%，而鸟嘌呤、腺嘌呤、脱氧腺苷含量相对较低，占核苷总量的13%。浙江省磐安县(S1、S2)和江苏省南通市(S5、S6)两个产地的样品中10种核苷类化合物栽培前后的总量均高于其他两个产地。栽培前后相比较，除浙江宁波产地外，其他产地浙贝母栽培后胞苷含量高于栽培前，4产地浙贝母样品栽培后核苷类成分(胞苷除外)含量及核苷总量均小于栽培前。

2.7 相关性分析

为了找出10种核苷类成分之间的联系，利用SPSS统计软件对浙贝母的10种核苷成分进行线性回归分析，保留因素P<0.05，发现各成分之间存在关联性。具体线性回归方程如下：

尿嘧啶=-1169.641+3.511×胞苷-4.710×鸟嘌呤+2.874×鸟苷+0.849×尿苷-1.211×脱氧肌苷+2.716×腺苷-1.955×脱氧腺苷

胞苷=333.089+0.285×尿嘧啶+1.341×鸟嘌呤-0.818×鸟苷-0.242×尿苷+0.345×脱氧肌苷-0.774×腺苷+0.557×脱氧腺苷

鸟嘌呤=-248.326-0.212×尿嘧啶+0.610×鸟苷+0.180×尿苷-0.257×脱氧肌苷+0.577×腺苷-0.415×脱氧腺苷+0.746×胞苷

鸟苷=406.974+0.348×尿嘧啶-1.222×胞苷+1.639×鸟嘌呤-0.296×尿苷+0.422×脱氧肌苷-0.945×腺苷+0.680×脱氧腺苷

腺嘌呤=-70.539+0.169×尿嘧啶+0.334×鸟嘌呤+0.141×尿苷+0.276×脱氧肌苷+0.017×鸟苷-0.244×腺苷+0.286×脱氧腺苷

尿苷=808.827-0.365×尿嘧啶-1.453×胞苷+0.410×鸟嘌呤-0.770×脱氧肌苷-0.506×脱氧腺苷-1.268×鸟苷+4.606×腺嘌呤

脱氧肌苷=698.692-0.400×尿嘧啶-1.025×胞苷-0.916×脱氧胸苷+0.363×腺苷-0.643×鸟苷+4.519×腺嘌呤-1.014×尿苷

脱氧胸苷=220.925-0.780×尿嘧啶-0.337×胞苷+0.247×鸟嘌呤+0.827×脱氧腺苷+0.237×鸟苷-0.160×尿苷-0.090×脱氧肌苷

腺苷=372.434+0.281×尿嘧啶-1.228×胞苷+1.519×鸟嘌呤-1.265×鸟苷-0.174×尿苷+0.525×脱氧肌苷+0.870×脱氧胸苷

脱氧腺苷=-53.724-0.101×尿嘧啶-0.189×鸟嘌呤-0.379×鸟苷+0.180×尿苷+0.147×脱氧肌苷+1.272×脱氧胸苷-0.073×腺苷

表4 不同产地栽前栽后浙贝母药材中10种核苷类成分的含量(μg·g-1，n=3)Table 4 The content of 10 nucleoside components of F. thunbergii Miq. sample before and after planting in different regions

2.8 主成分分析

应用SPSS分析软件对所有样品中10种核苷类成分含量进行主成分分析。提取标准为特征值大于1,得到3个主成分,累积贡献率达到86.10%。其中,第一主成分λ=4.171,方差贡献率为41.71%,包含的信息量大, 贡献率最高。第二主成分λ=2.411,方差贡献率为24.11%。第三主成分λ=2.028,方差贡献率为20.28%。主成分得分系数矩阵见表5。由表5可知，主成分1与尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、脱氧胸苷和脱氧腺苷5个成分的相关性高于其他核苷类成分，相关系数在0.186～0.198之间。

将SPSS软件给出的主成分得分系数乘以主成分相对应的特征值的平方根,便得到3个主成分中每个指标所对应的系数,关系式如下:F1=0.386X尿嘧啶-0.112X胞苷+0.380X腺嘌呤+0.380X尿苷+0.319X腺苷+0.241X鸟嘌呤+0.268X鸟苷-0.067X脱氧肌苷+0.390X脱氧胸苷+0.404X脱氧腺苷；F2=-0.253X尿嘧啶+0.446X胞苷+0.371X腺嘌呤+0.244X尿苷-0.157X腺苷+0.533X鸟嘌呤+0.245X鸟苷+0.102X脱氧肌苷-0.252X脱氧胸苷-0.311X脱氧腺苷；F3=-0.269X尿嘧啶-0.394X胞苷+0.081X腺嘌呤+0.179X尿苷+0.471X腺苷+0.011X鸟嘌呤-0.150X鸟苷+0.654X脱氧肌苷-0.246X脱氧胸苷-0.030X脱氧腺苷。

表5 8批样品中主成分得分系数矩阵Table 5 Principal component score coefficient matrix in 8 batches of samples

3 讨论

核苷类化合物主要包括核苷、核苷碱基及相关衍生物，是许多抗肿瘤、抗病毒药物的中间体，具有多种生物学活性[9-10]。中药材的核苷类成分检测方法主要为HPLC法，具有操作简便，精密度、稳定性和重复性良好等优点。相关研究表明，对于不同药材中核苷类物质的测定，HPLC的流动相使用有所不同。陈启宏等[11]采用HPLC法以1%冰醋酸-甲醇为流动相准确测定了斑蝥中尿嘧啶、尿嘧啶核苷、次黄嘌呤3种核苷类成分。夏成凯等[12]采用HPLC法以乙腈-水为流动相准确测定了半夏及其伪品中尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷4种核苷类成分。周恒等[13]采用HPLC法以乙酸铵-甲醇为流动相准确测定了沪地龙中包括尿苷、肌苷、鸟苷等7种核苷类成分。本研究中采用甲醇-水体系作为流动相，同时测定了不同产地浙贝母中的10种核苷类化合物，其方法学考察均符合要求，适用于浙贝母药材中核苷类物质的测定。

本研究对4个产地浙贝母药材中10种核苷类化合物测定结果显示：4个产地的浙贝母样品中均检测出10种成分的存在，表明不同产地浙贝母的核苷类成分较为相似，但不同产地各核苷成分所占其核苷类成分总量比例不同，核苷组成比例因产地不同存在差异。据报道，不同的核苷组成比例对免疫系统具有不同的作用[14-15]，说明各核苷类成分之间的含量比与药效具有相关性。推测这种组成含量差异是造成浙贝母药效差异的主要原因。在主成分分析中，第一主成分F1与除胞苷及脱氧肌苷外8种核苷类成分均呈正相关，其中与尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、脱氧胸苷和脱氧腺苷的正相关性较强，且主成分1贡献率最大，达41.71%，说明尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、脱氧胸苷和脱氧腺苷5个成分在浙贝母中核苷类成分的质量控制方面具有重要作用。

比较4个产地浙贝母栽培前后10种核苷类化合物含量，发现与栽培前相比，除胞苷含量在栽培后增多，其余核苷含量均不同程度降低，栽培后10种核苷类化合物的总量均小于栽培前。原因可能是浙贝母生长过程中土壤肥力不足，生长期未及时追肥所致[16]。栽培前4个产地核苷总量大小为：S1>S5>S3>S7，而栽培后则为：S6>S2>S4>S8，可以看出，浙江省磐安县(S1、S2)与江苏省南通市(S5、S6)产地浙贝母在栽培前后核苷总量均高于其它两个产地，可做为优质种源产地。核苷类化合物已被证实是浙贝母中重要的生物活性物质，与浙贝母药效(抗炎、祛痰等)具有一定的关联性[17]。其中，胞苷不仅是很多抗病毒、抗肿瘤和抗艾滋病药物的良好中间体,也是基因工程研究的重要原材料[18]。因此建议在浙贝母栽培过程中适当使用含有核苷酸盐成分的营养素为其补充养分，以保持浙贝母有效药用成分的含量。

本研究建立了HPLC测定浙贝母10种核苷类成分含量的方法，该方法灵敏度高，分离效果好，结果稳定可靠。同时比较了4个不同产地浙贝母栽培前与栽培后核苷类物质的含量差异，为浙贝母质量评价，品种选育提供参考。