王 伟 刘星雨 尚云龙 姚建标 王建方 宋永标 王如伟∗

（1.浙江中医药大学药学院， 浙江 杭州310052； 2.浙江康恩贝制药股份有限公司， 浙江 杭州310052；3.浙江省中药制药技术重点实验室， 浙江 杭州310052； 4.内蒙古康恩贝药业有限公司圣龙分公司，内蒙古 鄂尔多斯017400）

“血清药物化学” 这一理论最先由德国科学家格哈德·多马克所提出［1］，后来我国科学家王喜军教授［2］提出符合中医药理论的中药血清药物化学。中药成分较为复杂［3］，经口服给药后，普遍认为发挥药效的活性成分应该是被吸收入血的成分［4］。通过分析口服给药后血中成分，可确定中药在体内直接起作用药效成分。网络药理学［4⁃7］通过生物学网络中节点的连接和关系来分析药物对疾病网络的干预，从整体效应角度预测药物靶点，是阐明中药复方作用机制的重要手段之一。近年来文献［8⁃12］报道的网络药理学研究大多数是以各数据库中成分的口服生物利用度为筛选指标。然而多味中药在组成复方后，其原本的一些成分在其它成分的协同作用下，会使其原本较低的生物利用度得到改善，并且更改相应的药物剂型也会提高其生物利用度［13⁃14］。因此对于多成分的中药复方制剂，仅靠数据库中的口服生物利用度为筛选指标，会导致靶点预测不够精确。麝香通心滴丸为内蒙古康恩贝药业有限公司圣龙分公司已上市产品，收载于2015 年版《中国药典》 一部，于2017 年1 月13 日被列入国家中药保护品种，全方包括麝香、蟾酥、人参茎叶总皂苷、丹参、人工牛黄、熊胆粉、冰片，该品种属于心脑血管领域用药［15⁃17］。虽然临床上治疗冠心病疗效显著，但其药效物质基础并不明确。本文通过HPLC⁃Q⁃TOF／MS 对麝香通心滴丸进行血清药物化学研究，并基于网络药理学对入血成分治疗冠心病的作用机制进行研究，为深入阐明麝香通心滴丸作用机制提供一定的依据。

1 材料

1.1 仪器 1260 高效液相色谱仪、6530 Q⁃TOF／MS 四极杆飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司）；高速冷冻离心机、涡旋振荡器（美国赛默飞世尔科技公司）；Sartorius BS210S十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试剂与药物 麝香通心滴丸（内蒙古康恩贝有限公司圣龙分公 司，批 号180607）。蟾毒灵（批 号111981⁃201501，纯度99.2%）、熊去氧胆酸（批号110755⁃201704，纯度99.4%）、脂蟾毒配基（批号110718⁃201809，纯度98%）购自中国食品药品检定研究院；远华蟾毒精（批号PS010798，纯度98%）、去乙酰华蟾毒精（批号PS010804，纯度98%）购自成都普思生物科技股份有限公司；沙蟾毒精（批号5283，纯度98%）、甘氨胆酸（批号6723，纯度98%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；牛磺胆酸（批号PST190801⁃061，纯度98%）购自成都乐美天医药科技有限公司。乙腈（批号SHBK3440，色谱纯）、甲醇（批号10958407824，色谱纯）购自默克化工技术（上海）有限公司。

1.3 动物 5 只SPF 级健康雄性SD 大鼠，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2013⁃0016，由浙江中医药大学动物实验中心代为饲养，使用许可证号 SYXK（浙）2013⁃0184，条件为温度（22±1）℃，相对湿度50%～60%，12 h 光照，通风频率15～20 次／h。大鼠以标准饲料喂养，饮水自由，伦理审查决议编号ZSLL⁃2017⁃054。

2 方法

2.1 麝香通心滴丸入血成分分析

2.1.1 麝香通心滴丸混悬液制备 取适量麝香通心滴丸粉研磨成粉末，加入适量0.5%羧甲基纤维素钠溶液，调整质量浓度为0.4 g／mL，即得，摇匀备用。

2.1.2 动物给药与血清样品采集 SD 大鼠给药前禁食12 h，自由饮水，以6.4 g／kg 剂量给药。给药前采集空白血样，在给药15、30、45、60 min 后眼眶取血各约0.5 mL，收集至EP 管中静 置30 min，室温下以3 000 r／min 离心10 min，取上层血清，备用。

2.1.3 血清样本处理 分别精密吸取200 μL 空白血清和含药血清（将“2.1.2” 项下4 个时间点含药血清各吸取50 μL 混匀）于1.5 mL EP 管内，加入5 倍量甲醇涡旋5 min，离心（4 ℃、10 000 r／min）10 min，上清液于常温下氮气吹干，100 μL 甲醇复溶，涡旋5 min，离心（4 ℃、10 000 r／min）5 min，取上清液供MS 分析。

2.1.4 色谱条件 Hydro⁃RP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流动相0.4% 甲酸乙腈（A）⁃0.2% 甲酸水（B），梯度洗脱（0～5 min，5% A；5～13 min，5～20% A；13～40 min，20～22% A；40～60 min，22～45% A；60～75 min，45～75 A%）；柱温30 ℃；体积流量1.3 mL／min；进样量10 μL。

2.1.5 质谱条件 离子源ESI，扫描方式ESI＋、ESI⁃模式；干燥气体温度320 ℃，体积流量10 L／min；鞘气温度350 ℃，体积流量12 L／min；碎裂能量175 V；毛细管电压3 kV；正负离子采集范围m／z50～1 500。

2.2 网络药理学研究

2.2.1 预测潜在靶点 将分析得到的麝香通心滴丸入血成分通过PubChem 数据库得到其mol2 格式文件，并将其上传至PharmMapper 服务器（限定靶蛋白为人类，其余为默认选项），采用“药效团匹配方法” 得到虚拟筛选结果。将筛选出的分子⁃靶点匹配度（Fit Score）大于等于3 的药物靶点作为靶蛋白，并通过UniProt 数据库输入筛选得到的蛋白靶点PDBID，经检索和转化操作得到的麝香通心滴丸入血成分的潜 在作用靶点。通 过 GeneCards 数据库，以“coronary atherosclerotic heart disease” 为关键词，检索与冠心病相关的基因，并与上述成分靶点匹配进行分析，筛选与麝香通心滴丸入血成分相关的作用靶点。

2.2.2 蛋白相互作用网络构建与分析 String 数据库是一种包含已知和预测蛋白质与蛋白质相互作用的数据库，将上述成分⁃疾病交集靶点导入String 数据库，限定物种为人类（Homo sapiens），最低相互作用阀值设为高等置信度0.9 “highest confidence”，同时显示设置隐藏游离点，然后下载PPI 图形件并保存tsv 文件，最后使用R 语言对得到的PPI 进行核心基因的筛选，其余参数保持默认设置。

2.2.3 靶标GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 本研究通过David 6.7 数据库，对成分⁃疾病交集靶点蛋白进行GO富集分析、KEGG 通路富集分析，其中GO 富集分析包括生物过程（biological process）、分子功能（molecularfunction）和细胞组分（cellular component）3 个部分，Select Identifier设置为Official GeneSymbol，List Type 设置为Gene List，限定物种为人，并用FDR 错误控制法对P 值作检验校正，最终以“P＜0.05” 作为条件进行筛选，筛选出具有显著差异的代谢通路。

2.2.4 入血成分与核心靶点的分子对接 对上述麝香通心滴丸的入血成分与核心靶基因进行分子对接，首先通过PubChem 数据库得到各分子的化学结构式。在PDB 数据库检索靶基因蛋白构象，并根据以下条件筛选：通过X 晶体衍射法获取的蛋白结构；蛋白的晶体解析度小于3 Å；分型明确的蛋白。然后，使用AutoTools 对蛋白进行加氢去除水分子预处理，AutoGrid 进行能量格点计算，Autodock Vina 进行小分子与蛋白对接，对每个对接进行结合能（af⁃finity）评分，PyMoL 作活性分子和蛋白的互相作用图。

3 结果

3.1 麝香通心滴丸大鼠入血成分分析 健康大鼠灌胃给予麝香通心滴丸混悬液后，血清样品的正负离子图（BPC 模式）见图1，与对照品离子图比对后共鉴定出8 种入血成分，见表1。

表1 麝香通心滴丸入血成分

化合物1：正离子模式下，一级质谱分析其准分子离子为m／z417.227 1 ［M＋H］＋，保留时间为41.239 min，对其进行二级质谱分析，结果见图2，其主要的碎片离子有m／z399.215 2 ［M⁃H2O＋H］＋、363.191 7 ［M⁃3H2O＋H］＋。将沙蟾毒精的标准品溶液进行HPLC⁃MS／MS 分析，所得的一级与二级质谱及保留时间与化合物1 相同，由此确认其为沙蟾毒精。

图1 样品血清离子图

化合物2：负离子模式下，一级质谱分析其准分子离子为m／z514.283 3 ［M⁃H］-，保留时间为52.446 min，对其进行二级质谱分析，结果见图3，其主要的碎片离子m／z496.271 6 为准分子离子失去1 分子H2O ［M⁃H2O⁃H］-。将牛磺胆酸的标准品溶液进行HPLC⁃MS／MS 分析，所得的一级与二级质谱及保留时间与化合物2 相同，由此确认其为牛磺胆酸。

图2 沙蟾毒精质谱图

图3 牛磺胆酸质谱图

化合物3：正离子模式下，一级质谱分析其准分子离子为m／z403.247 1 ［M＋H］＋，保留时间为55.824 min，对其进行二级质谱分析，结果见图4，其主要的碎片离子有m／z367.226 4 ［M⁃2H2O＋H］＋、349.216 3 ［M⁃3H2O＋H］＋、253.193 9 ［M⁃C5H9O5＋H］＋、215.179 0 ［M⁃C8H11O5＋H］＋。将远华蟾毒精的标准品溶液进行HPLC⁃MS／MS 分析，所得的一级与二级质谱及保留时间与化合物3 相同，由此确认其为远华蟾毒精。

图4 远华蟾毒精质谱图

化合物4：负离子模式下，一级质谱分析其准分子离子为m／z464.302 5 ［M⁃H］，保留时间为56.952 min，对其进行二级质谱分析，结果见图5，其主要的碎片离子m／z402.299 6 为准分子离子失去1 分子水和1 分子羧基［M⁃H2O⁃COOH⁃H］-。将甘氨胆酸的标准品溶液进行HPLC⁃MS／MS 分析，所得的一级与二级质谱及保留时间与化合物4 相同，由此确认其为甘氨胆酸。

图5 甘氨胆酸质谱图

化合物5：正离子模式下，一级质谱分析其准分子离子为m／z401.231 3 ［M＋H］＋，保留时间为60.756 min，对其进行二级质谱分析，结果见图6，其主要的碎片离子为准分子离子m／z365.200 9 失去2 分子H2O ［M⁃H2O＋H］＋。将去乙酰华蟾毒精的标准品溶液进行HPLC⁃MS／MS 分析，所得的一级与二级质谱及保留时间与化合物5 相同，由此确认其为去乙酰华蟾毒精。

图6 去乙酰华蟾毒精质谱图

化合物6：正离子模式下，一级质谱分析其准分子离子为m／z387.251 6 ［M＋H］＋，保留时间为62.649 min，对其进行二级质谱分析，结果见图7，其主要的碎片离子有m／z369.242 1 ［M⁃H2O ＋H］＋、351.231 3 ［M⁃2H2O ＋H］＋、255.209 6 ［M⁃C5H7O4］＋。将蟾毒灵的标准品溶液进行HPLC⁃MS／MS 分析，所得的一级与二级质谱及保留时间与化合物6 相同，由此确认其为蟾毒灵。

图7 蟾毒灵质谱图

化合物7：负离子模式下，一级质谱分析其准分子离子为m／z437.290 6 ［M＋COOH］-，保留时间为65.025 min，对其进行二级质谱分析，结果见图8，其主要的碎片离子m／z391.284 3 为准分子离子失去1 分子甲酸［M⁃HCOOH］-。将熊去氧胆酸的标准品溶液进行HPLC⁃MS／MS 分析，所得的一级与二级质谱及保留时间与化合物7 相同，由此确认其为熊去氧胆酸。

图8 熊去氧胆酸质谱图

化合物8：在正离子模式下，一级质谱分析其准分子离子为m／z385.237 2 ［M＋H］＋，保留时间为68.868 min，对其进行二级质谱分析，结果见图9，其主要的碎片离子有m／z367.227 2 ［M⁃H2O＋H］＋、349.214 9 ［M⁃2H2O＋H］＋、253.194 8 ［M⁃C5H7O4］＋。将脂蟾毒配基的标准品溶液进行HPLC⁃MS／MS 分析，所得的一级与二级质谱及保留时间与化合物8 相同，由此确认其为脂蟾毒配基。

3.2 麝香通心滴丸入血成分网络药理学研究

3.2.1 作用靶点预测 将麝香通心滴丸8 个入血成分上传至PharmMapper 数据库后得到的所有靶点，删除重复并整合得到作用靶点249 个。通过与GeneCards 数据库中的1 778个与冠心病相关基因进行匹配，并通过R 软件绘制韦恩图，筛选出134 个成分⁃疾病交集靶点，见表2、图10。再通过Cytoscape 3.7.1 软件将8 个入血成分与134 个成分⁃疾病交集靶点相连，绘制出麝香通心滴丸的药物⁃靶点相互作用的网络图，见图11。

3.2.2 蛋白相互作用网络构建与分析 将韦恩图得到的134 个交集基因输入String 数据库中进行分析得到PPI 图，见图12，其中包括134 个节点，347 条边，平均节点度值为5.18，PPI 富集P 值少于1.0×1016，其中节点表示蛋白，每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多表示关联度越大。将String 中下载的tsv 文件用R 语言进行处理（以各蛋白连接的节点个数为指标，列举节点数排名前30 个的蛋白），得到PPI 中的核心基因丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3 激酶（PIK3R1）等核心基因，见图13。

图9 脂蟾毒配基质谱图

表2 成分⁃疾病交集靶点

图10 药物⁃疾病交集靶标韦恩图

3.2.3 靶标GO 富集分析及通路富集分析结果 利用David 6.7 平台对134 个药物⁃疾病交集靶点进行GO 富集分析及通路富集分析。GO 富集分析包括分子功能分析、细胞组分分析、生物学过程分析，以⁃lgP值进行排名并列出排名前15 的途径，见图14。在分子功能层面主要涉及类固醇激素受体活性、配体依赖性核受体活性等方面；在细胞组分层面主要涉及细胞外基质、细胞质、细胞质囊泡等方面；生物学过程层面主要涉及有机物质的反应、内源性刺激的反应、激素刺激的反应、调节细胞增殖等方面。对富集得到的通路结果，以⁃lgP值及各通路连接的基因数从大到小进行排名，见图15。通过查阅文献，该8 个入血成分可能通过ErbB signaling pathway、VEGF signaling pathway、PPAR signaling pathway 等信号通路治疗冠心病。

图11 药物⁃靶点相互作用网络图

图12 麝香通心滴丸入血成分与疾病共有靶点PPI 网络图

3.2.4 分子对接 讲上述8 个入血成分与上述互作关系排名前10 的核心靶点进行分子对接，结果见表3，结合能（affinity）越小则对接结果越好，affinity＜-7 表示具有较好的结合活性，可见该8 个入血成分与大多数核心靶点对接结果基本较好。其中，去乙酰华蟾毒精与MAPK1 结合活性最高，其分子对接细节模拟见图16，可知小分子结合在蛋白的活性口袋，并且有和活性口袋有较好的匹配。

4 讨论

本文前期按照一定梯度浓度探索麝香通心滴丸最佳给药剂量［18］，分别以0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g／kg 的给药剂量对SD 大鼠进行灌胃，并对各剂量组下的大鼠分别于给药15、30、45、60、75、90、105、120 min 后进行眼眶取血并分析血样。结果，大鼠在6.4、12.8 g／kg 剂量下各时间段含药血清的离子流图更丰富，并且基本一致，但12.8 g／kg 较为浓稠，给灌胃带来不便。最终，以6.4 g／kg为大鼠给药剂量。

图13 节点数目前30 的靶点

本研究参考文献［19⁃20］，分别采用甲醇和乙腈沉淀血清中的蛋白，发现甲醇沉淀处理得到的血中移行成分数目较多，内源性杂志干扰较少，因此提取溶剂选用甲醇。前期考察了15、30、45、60、75、90、105、120 min 共8个采血点，对血清样本质谱数据进行分析，发现不同的入血成分会出现在不同采血时间点样本中，然而在60 min 后其入血成分的提取离子流响应较低，因此选择混合前4 个取血点的血样进行分析。

大多数中药口服给药后，移行入血的成分才可能发挥药效，通过分析口服给药后血清中的入血成分来确定中药于体内直接作用物质，已成为确定中药药效物质基础的有效途径。本文基于HPLC⁃Q⁃TOF／MS 对麝香通心滴丸进行血清药物化学研究，通过与对照品比对鉴定出8 个成分，文献［21⁃22］报道，沙蟾毒精、远华蟾毒精、脂蟾毒配基、蟾毒灵等均具有一定强心的作用。

图14 入血成分与疾病交集靶点GO 富集

图15 KEGG 通路富集

表3 有效成分与核心靶点的分子对接

图16 去乙酰华蟾毒精与MAPK1 的分子对接细节图

Pharm Mapper 是预测化合物生物活性，并建立相应的公共网络服务器［23］。本研究通过该服务器，采用反向药效团匹配方法得到虚拟筛选结果，并与GeneCards 数据库中治疗冠心病相关的靶点相结合，得到134 个作用靶点，通过David 数据库对其进行KEGG 通路分析，发现这8 种入血成分有较多基因靶点有富集在与冠心病相关的通路上。通过Autodock Vina［24］对上述入血成分与核心靶基因进行分子对接，结果显示入血成分与核心靶点结合性较好。

冠心病是冠状动脉发生动脉粥样硬化，导致血管腔狭窄甚至阻塞，造成心肌缺血、缺氧而导致的心脏病。细胞凋亡是冠心病病理过程的重要因素，抗凋亡基因Bcl⁃2 和促凋亡基因Bax 共同参与［25］，ErbB signaling pathway 通路与细胞凋亡密切相关，其中Bcl⁃2 家族在内源性凋亡过程中起重要调控作用［26］。研究表明心肌细胞心肌缺血损伤后可通过活化ErbB signaling pathway 通路，诱导内源性Nrg⁃1 下调促凋亡分子Bax 表达，减轻细胞由于缺氧复氧而造成氧化应激的损伤。Lin 等［27］通过Na2S2O4诱导H9c2 细胞氧化应激后，在细胞培养液中加入一定浓度的麝香通心滴丸后，结果表明麝香通心滴丸显着提高了Na2S2O4处理诱导的H9c2 心肌细胞的活力并抑制了其异常形态学变化麝香通心滴丸预处理可减轻Na2S2O4引起的缺氧损伤，下调H9c2 细胞凋亡前Bax 的表达，并上调抗凋亡Bcl⁃2 的表达。

麝香通心滴丸具有调节过PPAR 信号通路的潜在作用。PPAR 信号通路对冠心病的发展和糖代谢起着重要的调节作用。PPAR 主要有PPARα、PPARβ 和PPARγ 三种表型。研究表明，PPARα 和PPARγ 的激活能通过抑制血管内皮炎症反应，抑制细胞增殖和迁移，抑制单核细胞转化成泡沫细胞，减少血管细胞黏附分子⁃1、ICAM1 表达等多个方面，发挥治疗冠心病的作用［28］。PPAR⁃γ 对糖代谢的调节主要是增加外周组织对胰岛素的敏感性，从而改善胰岛素抵抗［29］。本研究发现PPAR 信号通路上有麝香通心滴丸与冠心病的 共同靶 点PPARA、APOA2、PPARD、RXRB、RXRA、PPARG、FABP3、MMP1、FABP5、NR1H3，因此，推测麝香通心滴丸可能通过调节PPAR 信号通路，改善胰岛素抵抗来治疗冠心病。

血管内皮生长因子（VEGF）是调节生理或病理的血管新生及增加血管通透性的一个重要细胞因子，它与内皮细胞上的受体结合后会提高微血管的通透性，导致大量的炎性细胞渗入肺间质并产生胶原酶降解内皮下基底膜及细胞外基质，进而促进内皮细胞增生迁移，从而形成新生血管［30］。VEGFR2 是VEGF 的主要功能受体，其与VEGF 相结合主要介导血管的生成，VEGF／VEGFR2 信号通路是VEGF 信号通路中的主要信号通路，可促进血管内皮细胞的增殖、迁移、分化，同时抑制其调亡。VEGF 是血管生成过程中具有关键性的生长因子，可以增加血管密度，促进缺氧区甚至无血管区域内皮细胞增殖，诱导缺血组织内的血管新生，是目前临床上已知的最强的内皮细胞有丝分裂原，可有效促进心肌重塑［31］，本研究发现VEGF signaling pathway 通路上有麝香通心滴丸与冠心病的共同靶点PIK3CG、CDC42、MAPK1、MAP2K1、MAPK14、PLA2G2A、RAF1、SRC、PIK3R1、KDR、AKT2，因此推测麝香通心滴丸可能通过调节VEGF signaling pathway 通路来治疗冠心病。

综上所述，本研究基于血清药物化学与网络药理学，在体内化学成分分析辨识的基础上通过关联网络构建及分析，初步阐释了麝香通心滴丸治疗冠心病作用机制，可为中药药效物质基础分析及其相关作用机制探究提供一定依据。