叶 婷 徐利娟 藏 登 李 静 马 丽∗

（1.新疆医科大学第四附属医院内分泌科， 新疆 乌鲁木齐830061； 2.新疆医科大学第四临床医学院，新疆 乌鲁木齐830000）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常见的微血管并发症之一［1］，也是导致慢性肾功能衰竭的主要原因之一，并且已经成为终末期肾病的首要原因［2］，其发病机制复杂，近年来研究发现炎症是病情发生发展的主要因素。不同于传统的以红、肿、热、痛为特点的炎症，糖尿病肾病是一种因糖代谢紊乱而导致的代谢性炎症［3］，在其发展过程中，在肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）等炎症细胞因子的作用下上调黏附分子和趋化因子的分泌，从而进一步有利于白细胞渗入到肾小球局部，导致肾小球系膜细胞的增生和基质分泌增多，促进病情发生与进展。近年来，中药预防糖尿病肾病的发生发展受到了广泛关注，糖肾灌肠方作为我院协定处方，具有改善患者营养状况、减少尿蛋白、改善肾功能、延缓糖尿病肾病的发展的作用［4⁃6］，但是否具有预防作用尚未深入考察，故本研究观察该方相关作用，并探寻其作用机制。

1 材料

1.1 动物 昆明种小鼠42 只，SPF 级，体质量（20±2）g，由新疆维吾尔自治区疾控中心实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（新）2016⁃0003，分笼饲养，每笼5 只，相对湿度40%～70%，温度20～26 ℃，自由光线，自由摄食摄水，适应性饲养1 周。

1.2 药物 糖肾灌肠方由生大黄30 g、煅牡蛎50 g、泽泻30 g、丹参15 g、槐花30 g、黑顺片15 g、黄芩30 g 组成，由新疆医科大学第四附属医院药剂科提供，药理研究室制作浸膏，方法为15 kg 药材加12 倍量水煎煮2 次，每次1.5 h，提取液过滤减压浓缩成稠膏，再减压干燥，得3.975 kg 干浸膏，得率为26.5%，每22 g 浸膏溶于8.33 mL蒸馏水中。

1.3 试剂 链脲佐菌素（STZ）（北京索莱宝科技有限公司，批号614J031）；考马斯亮蓝贮备液（南京建成生物工程研究所）；拜安捷2 代血糖测定仪（上海健臻医疗科技有限责任公司）；TNF⁃α 试剂盒（伊莱瑞特公司，货号E⁃EL⁃M0049c）。

1.4 仪器 电子天平（德国Sartoriu 公司）；酶标仪（型号MULTISKAN，美国Thermo 公司）.

2 方法

2.1 造模 小鼠适应性饲养1 周后，随机选取10 只为正常组，予普通饲料喂养；按照既往造模方法［7⁃8］，其余32只随机分为模型组、干预组，给予高糖高脂饲料（2.5%胆固醇、10%熟猪油、1%胆盐、20%蔗糖、66.5%基础饲料）喂养，饮用水为高压灭菌水。每3 d 更换1 次垫料，高糖高脂喂养4 周后造模组小鼠禁食不禁水12 h，给予STZ 溶液（60 mg／kg）腹腔注射，3 d 后予STZ 溶液（90 mg／kg）腹腔注射；正常组予等体积柠檬酸缓冲液腹腔注射。给药4 d 后小鼠断尾取血，血糖值≥11.1 mmol／L 判定为糖尿病造模成功；此时干预组给予糖肾灌肠方灌肠，继续高糖高脂饲料喂养6 周。给药结束次日，处死干预组小鼠，收集尿液，以尿微量白蛋白＞30 mg／L 判断为糖尿病肾病造模成功。

2.2 分组与给药 干预组小鼠于糖尿病模型造模成功后予糖肾灌肠方灌肠，前一晚20 点左右撤食不撤水，灌肠前将小鼠放在鼠笼栅栏盖上，让前爪抓住栅栏，轻提尾部使后爪悬空，有轻微前倾趋势，使肛门充分暴露；从腹部向肛门部用另一只手轻轻地挤压以协助排便。排便后，在小鼠肛门呈舒张状态时将灌肠器头部涂上润滑剂，并缓慢、轻柔地送入肛门，直达结肠部位。给予高糖高脂饲料喂养，给药6 周，每天1 次，剂量依据成人给药量折算后以0.07 mL／10 g 灌肠［9］，糖肾灌肠方药物总量为200 g，成人体质量按60 kg 计算，则成人给药剂量为200 g／60 kg，人与小鼠折算剂量为9.1，故小鼠给药剂量为30 g／kg，以2倍药量给药，相当于生药量0.6 g／10 g，每22 g 浸膏溶于8.33 mL 蒸馏水中，以0.07 mL／10 g 剂量灌肠。

2.3 小鼠肾脏指数测定 麻醉前各组称取小鼠体质量，麻醉后放血处死，立即剖腹游离出肾脏，滤纸吸干血迹后用电子天平称肾湿质量，计算肾脏指数（肾湿质量／体质量）。

2.4 尿蛋白测定 给药结束后收集各组小鼠尿液，考马斯亮蓝法检测尿蛋白。

2.5 血肌酐测定 给药结束后取血，Hitachi 7170A 型自动生化分析仪测定各组血清样品中肌酐水平。

2.6 肾脏组织HE 染色 给药结束后麻醉放血处死小鼠，立即剖腹游离出肾脏，冰盐水灌洗后分离肾皮质，常规脱水，石蜡包埋，切片，然后脱蜡，HE 染色，脱水，透明，封片。

2.7 肾脏组织超微结构观察 给药结束后麻醉放血处死小鼠后，立即剖腹游离出肾脏，以冰盐水灌洗肾脏后分离肾皮质，戊二醛固定，制作电镜切片，进行超微结构观察。

2.8 血清TNF⁃α 测定 使用小鼠TNF⁃α ELISA 试剂盒检测血清TNF⁃α 水平，严格按照说明书步骤操作。

2.9 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行分析，数据以（）表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐时采用LSD 法进行组间多重比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3 法进行组间多重比较，检验水准α＝0.05，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况 在造模过程中，正常组小鼠毛色光亮，无脱毛，活动自如；造模组小鼠明显瘦小，毛较粗糙，色泽黯淡，出现精神萎靡，活动迟缓、消瘦、多饮、多尿等症状；实验过程中因造模时间过长、小鼠血糖过高，导致模型组死亡7 只，干预组死亡8 只。

3.2 各组小鼠肾脏指数 与正常组相比，模型组肾脏指数升高（P＜0.01）；与模型组相比，干预组肾脏指数降低（P＜0.01），见表1。

表1 各组肾脏指数比较（）

表1 各组肾脏指数比较（）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。

3.3 各组小鼠尿蛋白水平 模型组尿蛋白水平较正常组升高（P＜0.01），干预组尿蛋白水平较模型组降低（P＜0.01）；干预组与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠尿蛋白水平比较（）

表2 各组小鼠尿蛋白水平比较（）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

3.4 各组小鼠血肌酐水平 模型组较正常组血肌酐水平升高（P＜0.01），干预组血肌酐水平较模型组降低（P＜0.01）。见表3。

表3 各组血肌酐水平比较（）

表3 各组血肌酐水平比较（）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

3.5 各组小鼠肾脏HE 染色 正常组小鼠肾小球毛细血管袢开放良好，肾小球毛细血管壁薄而纤细，血管袢外被足细胞，肾小囊壁完整，纤细；模型组小鼠肾小球体积增大，肾小球细胞增多，毛细血管袢开放尚可，管壁僵硬，足细胞减少，肾小囊壁完整；干预组小鼠肾小球毛细血管袢开放尚可，细胞增多，部分足细胞减少，肾小囊壁完整。见图1。

图1 各组小鼠肾脏HE 染色（×400）

3.6 各组小鼠肾脏超微结构 正常组小鼠内皮细胞未见肿胀，系膜细胞未见明显增生，周围的系膜基质无扩大，足突细胞未见异常，仅见少量足突融合；模型组小鼠系膜细胞核畸形，系膜细胞增生，足细胞核外形不规则，血管腔闭塞，系膜基质不规则，系膜内可见中等电子密度沉积物，基底膜增厚、皱缩，毛细血管皱缩；干预组小鼠内皮细胞轻微肿胀，系膜细胞未见明显增生，系膜基质轻度增生，可见少量足突融合。见图2。

图2 各组小鼠肾脏超微结构（×8 000）

3.7 各组小鼠血清TNF⁃α 水平 与正常组相比，模型组及干预组小鼠TNF⁃α 升高（P＜0.01）；与模型组相比，干预组TNF⁃α 下降（P＜0.01），见表4。

表4 各组小鼠TNF⁃α 水平比较（）

表4 各组小鼠TNF⁃α 水平比较（）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。

4 讨论

DKD 是糖尿病主要微血管并发症之一，是慢性高血糖所致的肾脏损害，病变累及全肾。在我国，DKD 是终末期肾病的主要原因［10］。DKD 属于中医“消渴病肾病” 范畴，中医认为其发病机理为消渴病日久，耗气伤阴，病情迁延，阴损及阳，渐致痰、郁、湿、热等病理产物瘀阻血脉，津血交换受阻，废物积聚日久成毒，毒（糖毒、脂毒）随邪生入络，伏藏不去［11］。针对消渴病肾病发生的病机，以“生大黄、煅牡蛎、泽泻、黄芩” 等药物组方的糖肾灌肠方具有“调理脾肾、益气活血、扶正祛邪、泄浊解毒” 之功，作为我科协定处方长期应用于临床，疗效显著。

尿蛋白及血肌酐升高是DKD 的临床特点之一，在本研究中，干预组小鼠在疾病发展过程经糖肾灌肠方预防性治疗后尿蛋白及血肌酐水平低于模型组，肾脏指数较模型组减小；光镜下，模型组肾小球体积增大，肾小球细胞增多，管壁僵硬，足细胞减少；肾脏超微结构中模型组系膜细胞核畸形，系膜细胞增生，足细胞核外形不规则，血管腔闭塞，系膜基质不规则，系膜内可见电子密度沉积物，基底膜增厚、皱缩，毛细血管皱缩，表明DKD 造模成功；干预组病理结构改变较模型组轻微。由此可以证明：在糖尿病发生后，予糖肾灌肠方保留灌肠干预，可以延缓肾脏病理改变。

近来研究认为，固有免疫介导的慢性、低水平炎性反应在DKD 发生、发展中起核心作用［12⁃13］。因此，微炎症状态的改善是临床症状及病理结构改善的基础。TNF⁃α 主要由活化的单核／巨噬细胞产生，作为体内重要的炎性反应介质，参与早期DKD 肾血流动力学异常改变，不但能刺激肾小球系膜细胞收缩、增生、分泌炎性介质，也能刺激胶原和成纤维细胞产生，最终通过损伤内皮细胞激活内源性凝血和炎症机制［14］。TNF⁃α 过度释放会促进巨噬细胞浸润，导致肾小球基底膜增厚，加速肾小球硬化，此外，TNF⁃α还会使血管内皮舒张，引起肾小球血管收缩，从而导致肾血流动力学发生改变，致使肾小球滤过率降低［15］。本研究中模型组TNF⁃α 较正常组升高，与既往研究结论相符；干预组小鼠给予糖肾灌肠方预防性治疗6 周后，血清TNF⁃α水平较模型组低，提示糖肾灌肠方能够抑制糖尿病小鼠血清TNF⁃α 升高；

糖肾灌肠方中主药大黄，具有攻积导滞、泻火解毒、凉血化瘀、泄浊利尿等功效，现代药理学研究表明大黄对巨噬细胞的免疫活性具有双向调节作用，并且对TNF⁃α 及某些白细胞介素类的细胞因子具有一定的抑制作用［16⁃17］。刘超等研究结果表明：应用大黄的主要提取物大黄素后，实验小鼠外周血中的TNF⁃α 表达及脾细胞中TNF⁃α mRNA的表达均降低［18］，提示大黄具有抑制炎症反应的作用。佐以质重之牡砺，以敛阴潜阳，收敛固涩，化痰软坚；泽泻，气平，味甘而淡，最善渗泄水道，专能通行小便，研究表明，以泽泻为君药的泽泻汤治疗高脂血症大鼠后，大鼠腹腔巨噬细胞分泌的TNF⁃α 和IL⁃6 明显减少，说明其能够改善大鼠炎症状态［19］。黄芩，味苦，具有清热燥湿，泻火解毒之功，已有大量研究证明黄芩能够通过抑制多种炎症因子改善炎症状态，其中TNF⁃α 即为其重要的靶向分子之一［20］。诸药合用，契合消渴病肾病的病机；同时采用保留灌肠的方法给药是糖肾灌肠方的主要治疗优势。

人体75%的尿素氮通过肾脏代谢，25% 经肠道排泄，因此，当肾功能受损后，肠道成为尿素氮的主要代谢途径，中药灌肠疗法是在张仲景蜜煎导法基础上不断发展和完善起来的中医外治法；中药保留灌肠使部分药液在结肠内吸收，部分直接发挥作用，促使毒素从肠道排出，从而降低血肌酐、尿素氮的水平；另一方面，DKD 患者因多年的糖尿病，其胃肠功能均有不同程度损害，胃肠道症状突出，加之肾功不全毒素蓄积体内，刺激胃肠引发的胃肠中毒症状，导致服药成为困难，因此采用中药保留灌肠的方法能够避免因服药加重胃肠道不适。并且经肠道给药，药物通过肠黏膜被吸收，沿中、下直肠静脉进入下腔静脉，可避免肝脏的“首过效应”，保证有效血药浓度，减少了药物对肝脏的毒副作用，具有全身治疗作用。

综上所述，糖肾灌肠方通过肠道给药作用于全身，能够抑制血清TNF⁃α 水平升高，延缓肾脏病理结构改变，抑制DKD 小鼠尿蛋白及血肌酐水平，对DKD 起到预防作用。