胡江慧 刘艳菊 张方蕾∗ 许 静 林 雄 朱天翔

（1.湖北中医药大学药学院， 湖北 武汉430065； 2.湖北省中药炮制工程技术研究中心， 湖北 武汉430065）

黄芩是唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根［1］，具有清热燥湿、泻火解毒等功效，且具有抗炎、抗菌等多种药理作用，临床常用于治疗急性感染性疾病。研究发现，黄芩水提取物对脂多糖（LPS）所致ALI 大鼠具有保护作用［2⁃3］。黄芩首载于《神农本草经》［4］，分为子芩和枯芩。子芩质地坚实，枯芩质轻腐朽。据古籍记载子芩泻下焦大肠之火，枯芩善清上焦肺胃之热。目前市场上已不区分子芩和枯芩，统称黄芩。对两种规格饮片的药效差异课题组前期进行了研究。实验结果［5］表明，体外实验提示子芩与枯芩对肺炎链球菌有抑菌作用，体内实验表明两种饮片对肺炎模型大鼠有较好治疗作用，且枯芩明显优于子芩，初步明确两饮片的药效差异。为了进一步验证枯芩与子芩对上焦肺经的药效作用差异，拟以急性肺损伤小鼠为模型进行研究。

目前，脂多糖（LPS）已成为建立炎症反应的经典试剂，LPS 诱导鼠肺损伤已成为评价抗炎症反应药物的常用动物模型［6］。本文拟通过LPS 造模建立急性肺损伤模型，以地塞米松为阳性药，比较不同剂量的枯芩及子芩醇提物对该模型的药效，以期确定枯芩的临床作用，为精准用药、最大发挥其药效提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 摇摆式高速粉碎机（型号DFY⁃800C，温岭市林大机械有限公司）；艾柯实验室超纯水机（型号AKSW⁃V⁃08，成都艾柯水处理设备有限公司）；旋转蒸发器（型号RE⁃5205，上海亚荣生化仪器厂）；SCIENTZ⁃12N 冷冻干燥机（型号16⁃0071，宁波新芝生物科技股份有限公司）；医用低温保存箱（-80 ℃）（型号MDF⁃86V340E，安徽中科都菱商用电器股份有限公司）；酶标仪（型号EPOCH2，上海玉博生物科技有限公司）；奥林巴斯倒置显微镜［型号CKX53，成貫仪器（上海）有限公司］。

1.2 试剂与药物 子芩饮片（产地河南，批号20161217）、枯芩饮片（产地河南，批号20161207）均购自湖北天济中药饮片有限公司，经湖北中医药大学张秀桥教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。地塞米松片［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号L8880］。脂多糖（LPS）（北京索莱宝科技有限公司，批号813Q0312）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0012）；丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号A003⁃1）；髓过氧化物酶（MPO）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号A044）；白介素1β（IL⁃1β）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号E⁃EL⁃M 0037c）；白介素6（IL⁃6）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号E⁃EL⁃M0044c）；小鼠肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号E⁃EL⁃M0049c）；白细胞稀释液（南京建成生物工程研究所，批号C025⁃1⁃1）。

1.3 动物 C57BL／6 小鼠，雄性，SPF 级，体质量（20±2）g，由湖北省三峡大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK（鄂）2017⁃0067。

2 方法

2.1 药液制备 分别称取枯芩、子芩饮片，打粉，用10倍量70%乙醇加热回流提取2 次，第1 次2 h，第2 次1 h，合并2 次滤液，旋蒸，冷冻干燥，枯芩得率为39.82%；同法制备子芩醇提物，得率为43.48%。取2 种醇提物冻干粉适量至量瓶中，加入蒸馏水，定容，混匀，即得。

2.2 造模、分组及给药 112 只雄性C57BL／6 小鼠在相对湿度（55±5）%、温度（23±2）℃的实验室环境下适应性饲养1 周，按体质量随机分为正常组、模型组、阳性药组（地塞米松，10 mg／kg）、枯芩醇提物低剂量组（3.28 g／kg）、枯芩醇提物高剂量组（6.56 g／kg）、子芩醇提物低剂量组（3.58 g／kg）、子芩醇提物高剂量组（7.16 g／kg），每组16只，给药剂量为0.2 mL／10 g，正常组和模型组用蒸馏水灌胃。给药7 d 后进行造模，造模前24 h 禁食不禁水。第7天当天灌胃2 h 后实验组用LPS（10 mg／kg）滴鼻造模6 h，正常组滴鼻给予相同容量0.012 5 mL／10 g 磷酸盐缓冲液。

2.3 样品采集与处理 每组小鼠均分为2 批，1 批用于眼球取血及取肺组织，1 批用于肺泡灌洗［7］，眼球取血用于全血白细胞计数。采集小鼠肺组织，用PBS 冲洗干净，右肺上叶置于4%多聚甲醛固定，用于常规石蜡包埋，制作石蜡切片，HE 染色，显微镜下观察肺组织炎性细胞浸润程度；右肺中叶称湿重（wetweight，W），然后在干燥箱中以80 ℃烘48 h，测定干重（dryweight，D），以W／D评估肺组织的水肿程度［8］。左肺上叶用于MPO 活性测定和MDA水平测定，组织匀浆液于4 ℃、3 500 r／min 条件下离心10 min，取上清液，按照BCA、MPO 以及MDA 各试剂盒说明方法［9］测定蛋白浓度及MPO、MDA 水平。小鼠用水合氯醛麻醉后，剪开颈部皮肤，钝性分离颈部气管上方的肌肉，找到总气管，用剪刀剪一个T 形小口，插管结扎，用预冷的0.1 mol／L 磷酸盐缓冲液（PBS）进行全肺肺泡灌洗3 次，第1 次0.8 mL，第2 次0.5 mL，第3 次0.2 mL，每次抽洗都要匀速进行，灌洗液（BALF）在4 ℃、1 500 r／min条件下离心10 min，取上清液，采用ELISA 试剂盒对BALF 中IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α 水平进行测定［10］。

2.4 统计学分析 数据用SPSS21.0 软件进行分析，计量资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠肺组织湿干比重（W／D）如图1 所示，与正常组相比，LPS 诱导后小鼠肺组织W／D增大（P＜0.05），出现肺水肿；与模型组相比，枯芩、子芩醇提物高剂量组对小鼠急性肺损伤有改善作用，W／D下降（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 各组小鼠的肺组织湿干比重

3.2 小鼠肺组织病理切片 HE 染色（图2）显示，正常组肺组织结构清晰，肺泡壁较薄且无渗液，未见炎症细胞浸润；模型组肺组织结构紊乱，肺泡壁增宽增厚，肺间质出现水肿，并伴有大量炎症细胞浸润；各给药组情况都有所改善，枯芩醇提物高剂量组优于子芩醇提物各剂量组；枯芩醇提物高剂量组肺组织结构较清晰，肺泡壁较模型组更薄，接近正常组。

图2 各组小鼠肺组织病理切片（×200）

3.3 全血白细胞计数 如图3 所示，与正常组比较，模型组全血白细胞计数增多（P＜0.01），说明出现炎症；与模型组比较，枯芩醇提物各剂量组、子芩醇提物高剂量组全血白细胞计数减少（P＜0.05，P＜0.01），说明小鼠急性肺损伤有所改善。

图3 各组小鼠全血白细胞计数

3.4 丙二醛（MDA）水平 如图4 所示，LPS 诱导后模型组的MDA 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，枯芩、子芩醇提物各剂量组MDA 水平降低（P＜0.01）。

图4 各组小鼠MDA 水平

3.5 髓过氧化物酶（MPO）水平 如图5 所示，LPS 诱导后模型组MPO 水平升高（P＜0.01），给药组除子芩醇提物低剂量组外，MPO 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），对小鼠急性肺损伤均有显著改善作用。

3.6 肺泡灌洗液（BALF）中IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α 水平测定 如图6 所示，LPS 诱导后模型组肺泡灌洗液（BALF）中IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，枯芩、子芩醇提物各剂量组IL⁃1β、TNF⁃α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），两者高剂量组IL⁃6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

4 讨论

图5 各组小鼠MPO 水平

据文献记载，在古代及现代上世纪七十年代前，临床上习将黄芩分为子芩和枯芩使用，子芩主泻大肠湿热，枯芩主清肺胃上焦之热，药效确切。课题组前期研究已表明，枯芩在抑制肺炎链球菌以及抗炎的药理作用上效果均明显优于子芩，与文献相符。

急性肺损伤［11］（acute lung injury，ALI）是以低氧血症和呼吸窘迫为临床表现的危重症，严重时呈急性呼吸窘迫综合征，死亡率高达35%～55%，是呼吸内科危重病，病势迅猛。ALI 发病是由于肺内过度、失控的炎性反应所致。基于黄芩对肺部炎症良好的治疗作用，本实验进一步研究黄芩两种规格饮片对急性肺损伤的改善作用，以期用新的病症模型验证枯芩对肺部病症作用优于子芩的科学性。

本研究以C57BL／6 雄性小鼠为研究对象，通过LPS 建立急性肺损伤模型，LPS 是革兰阴性菌的主要致病成分［12］，是引起ALI 并最终导致患者死亡的重要原因之一，LPS 刺激下，炎症细胞迅速浸润肺组织，引起中性粒细胞和巨噬细胞浸润等炎症细胞聚集［13］。根据LPS 造模后小鼠HE 病理切片所呈现的炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，W／D升高，肺水肿，MDA、MPO 水平升高，小鼠肺组织发生了过氧化反应，且过氧化降解产物水平升高，IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α 和全血白细胞计数等指标均增多，小鼠肺组织发生炎症，炎症细胞浸润聚集肺组织。说明LPS 诱导的小鼠急性肺损伤模型的症状与临床上观察到的病理症状相似，可见LPS 滴鼻诱导小鼠急性肺损伤模型有效［14］。

本研究结果表明，阳性药地塞米松、枯芩和子芩醇提物均对由LPS 诱导的小鼠急性肺损伤有改善作用，使模型组小鼠症状减轻，可抑制肺组织过氧化，减少MPO、MDA等的生成和释放，进而减轻肺组织脂质过氧化损伤。在生理条件下，IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α 等炎症因子水平非常低，但在病理条件刺激下会大量分泌及释放［15］，本实验表明用药后可使炎症因子IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α 水平降低，并使全血白细胞数量生成减少，W／D降低，使肺水肿及炎性细胞浸润等情况得到改善。组间比较发现，枯芩组作用优于子芩组，枯芩醇提物高剂量组改善效果最佳，接近正常组，进一步验证了枯芩相较子芩对肺部炎症作用更有优势。综上所述，本实验可为黄芩在临床应用中有必要区分为子芩和枯芩提供实验依据。

图6 各组IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α 水平