邵珠莹 潘金火 张月婵 蒋志涛 王 雪 冯星月 王建春∗

（1.南京中医药大学药学院， 江苏 南京210023； 2.南京中医药大学附属张家港医院， 江苏省企业研究生工作站， 江苏 张家港215600）

关木通含马兜铃酸，20 世纪90 年代，国内外一些学者报道显示，应用关木通可导致以进展性肾小管间质损伤为主的肾毒性，国家药监局于2003 年取消了关木通的药用标准［1⁃3］。但马兜铃酸A 作为马兜铃属和细辛属植物中所共有的成分，在很多常用的中药中都含有，马兜铃、青木香、天仙藤、细辛、寻骨风、朱砂莲、广防己等［4］，这些中药临床应用广泛，所以一味地禁用或者全面否定并不是解决这些药物临床应用的最佳方法。在古代医药文献中药物毒性常是指这种药物的偏性，在中医理论看来，作为药物都有毒性，关键是要正确使用。笔者的前期研究报道显示［5］，UPLC⁃TQD⁃MS 法基于“辛开苦降” 理论探讨关木通配伍干姜的减毒存效机制，前期的结果显示干姜⁃关木通（2 ∶1）配伍煎煮后，关木通中的马兜铃酸A 降低率达87.79%，而配伍后的方剂对大鼠的利尿作用没有影响，且对大鼠急性肾功能损伤明显低于关木通生品。

干姜作为常用的药食同源中药材，据 《本草纲目》《本草经疏》 等记载，其性热，有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮等功效［6］。6⁃姜酚是干姜中的主要有效成分，研究发现其有抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及降压等作用［7］。为了验证药物配伍后对关木通的肾脏减毒作用，为含马兜铃酸A 的中药饮片现有临床应用问题提供一定的指导，本实验在体外观察比较了马兜铃酸A 和6⁃姜酚＋马兜铃酸A 对正常人肾小管上皮细胞HK⁃2 的影响。

1 材料

1.1 细胞 人正常肾小管上皮细胞（HK⁃2 细胞，批号20180322），购自中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂与药物 马兜铃酸A（批号PRF8010623）、6⁃姜酚（批号PRF8012005）购自上海源叶生物科技有限公司（纯度＞98%）；DMEM 培养基（以色列Biological Industries公司，批号171115⁃374）；胎牛血清（以色列Biological In⁃dustries 公司，批号Nu12955）；0.25% 胰蛋白酶（以色列Biological Industries 公司，批号J340823）；双抗混合液（青霉素、链霉素，以色列Biological Industries 公司，批号170218⁃385）；荧光素二乙酸酯（阿拉丁试剂有限公司，批号201804）；SOD 试剂盒、MDA 试剂盒、GSH 试剂盒、GSH⁃Px 试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20180234、20180626、20180321、20180422 ）；GAPDH Rabbit IgG（美国Santa Cruz 公司，批号A6765）；Rabbit polyclonal to NF⁃kB p65（英 国 Abcam 公 司，批 号GR568343⁃1）；Rabbit polyclonal to p⁃NF⁃kB p65（英 国Abcam 公 司，批 号 GR530813⁃2 ）；Caspase⁃3 Rabbit polyclonal IgG（美 国 Bioworld 公 司，批 号 CJ54654）；Cleaved⁃Caspase⁃3 Rabbit polyclonal IgG（美 国Bioworld 公司，批号JJ761202）。其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器 MicroCL 17R 高速低温离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；ELx800 酶标仪（美国伯腾仪器公司）；DMI3000B 倒置光学显微 镜（德国徕卡公司）；Master⁃D UVF 超纯水机（上海和泰仪器有限公司）；SK⁃O180⁃E 圆形摇床（大龙医疗设备有限公司）；EPS300 电泳电源、VE⁃180 垂直电泳槽、5300 凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；FS⁃500 封口仪（德清拜杰电气有限公司）。

2 方法

2.1 HK⁃2 细胞的培养 细胞置含10%胎牛血清的DMEM完全培养液中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，按生长状况用胰酶消化后，换液传代培养，取4～6 代用于后续实验。

2.2 马兜铃酸A 处理HK⁃2 细胞 精密称取马兜铃酸A 对照品适量，DMEM 培养液溶解稀释，得到40、20、10、5、1 μg／mL 对照品溶液，使用前用0.22 μm 微孔滤膜过滤。

将HK⁃2 细胞以5×105／mL 浓度接种于96 孔板中，每孔100 μL。实验分组为0（正常组）、1、5、10、20、40 μg／mL马兜铃酸A 组，每组10 个复孔，培养24 h，各孔加入CCK⁃8 试剂20 μL，继续培养4 h 后，在450 nm 波长下用酶标仪测定光密度（OD），计算细胞存活率，空白孔每孔加入200 μL DMEM 培养液，细胞存活率＝［（OD药物组-OD空白孔）／（OD正常组⁃OD空白孔）］×100%。

2.3 6⁃姜酚处理损伤的HK⁃2 细胞 精密称取6⁃姜酚对照品适量，用DMEM 培养液溶解并进行稀释，得到300、200、100、50 μg／mL 对照品溶液，使用前用0.22 μm 微孔滤膜过滤。

4～6 代HK⁃2 细胞用细胞计数板计数后，以DMEM 培养液稀释细胞，细胞浓度约为5×105／mL，接种于96 孔板，每孔100 μL，24 h 细胞孵育贴壁后，弃去原培养液。将细胞分为正常组、马兜铃酸A 组（10 μg／mL）、6⁃姜酚（50、100、200、300 μg／mL）＋马兜铃酸A（10 μg／mL）共处理组，每组10 个复孔，培养48 h 后每孔加入20 μL CCK⁃8 试剂，培养箱内继续培养4 h，在450 nm 波长下用酶标仪测定光密度（OD），确定6⁃姜酚最佳浓度。

2.4 FDA 活细胞荧光染色观察细胞形态 将细胞分为正常组、马兜铃酸A 组（10 μg／mL）、6⁃姜酚（200 μg／mL）＋马兜铃酸A（10 μg／mL）组，将细胞孵育完毕后，用移液枪弃去孔中的培养基。5 mg FDA 溶解于1 mL 丙酮，作为FDA／丙酮母液（5 mg／mL），PBS（1 ∶ 1 000）稀释 成10 μg／mL FDA／PBS 溶液，各孔加入200 μL 孵育10 min，弃去孔中液体，再加入PBS 缓冲液200 μL，5 min 后弃液，再加入PBS 缓冲液200 μL，倒置荧光显微镜于488 nm 波长处激发荧光并拍照。

2.5 Hoechst 荧光染色观察细胞凋亡 将细胞分为正常组、马兜铃酸A 组（10 μg／mL）、6⁃姜酚（200 μg／mL）＋马兜铃酸A（10 μg／mL）组，将细胞孵育完毕后，用移液器弃去孔中的培养基，各孔加入细胞固定液200 μL，固定10 min后弃固定液，各孔以200 μL PBS 缓冲液清洗3 次，弃所有液体，加入200 μL Hoechst 染色液，5 min 后弃染色液，各孔以200 μL PBS 缓冲液清洗3 次，最后1 次清洗后不丢弃上清液，倒置荧光显微镜于350 nm 波长处激发荧光并拍照。

2.6 吸光度法检测细胞上清SOD、MDA、GSH 和GSH⁃Px水平 将细胞分为正常组、马兜铃酸A 组（10 μg／mL）、6⁃姜酚（200 μg／mL）＋马兜铃酸A（10 μg／mL）组，孵育完毕后收集各孔上清液，按照SOD、MDA、GSH 和GSH⁃Px检测试剂盒的说明书，分光光度计测定吸光度，计算各组酶活性。

2.7 Western blot 检测蛋白表达 4～6 代HK⁃2 细胞计数后，DMEM 培养液稀释至细胞浓度约为1×106／mL，接种于6 孔板，每孔1 mL，12 h 细胞孵育贴壁后弃液。设正常组、马兜铃酸A 组（10 μg／mL）、6⁃姜酚（200 μg／mL）＋马兜铃酸A（10 μg／mL）组，每组设置6 个复孔，共3 组，各组加入含有对应药物的培养基2 mL，对照组加入DMEM 单培2 mL，培养48 h，细胞刮剥离细胞，收集至EP 管，裂解细胞并离心收集上清后，Bradford 法进行蛋白定量，蛋白变性后取等量总蛋白进行SDS⁃PAGE 电泳，将凝胶上的蛋白转移至PVDF 膜，封闭液封闭2 h，分离PVDF 膜，分开孵育GAPDH（1 ∶4 000）和NF⁃κB p65（1 ∶1 000）、p⁃NF⁃κB p65（1 ∶1 000）、caspase⁃3（1 ∶1 000）、cleaved⁃caspase⁃3（1 ∶1 000）抗体，4 ℃过夜后清膜3 次，兔二抗（1 ∶10 000）孵育2 h 后清洗膜3 次，凝胶成像体统化学发光成像。

2.8 统计学分析 荧光图片数据应用Image pro plus 软件计数，Western blot 数据应用Quatity one 软件统计灰度值，计量数据用（）表示，结果用Graph Pad Prism 5.0 软件进行方差分析和作图，多组间的比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 马兜铃酸A 对HK⁃2 细胞活性影响 与正常组相比，马兜铃酸A（5～40 μg／mL）降低HK⁃2 细胞存活率（P＜0.01），且呈浓度依赖性（表1）；5 μg／mL 马兜铃酸A 组细胞存活率接近75%，20、40 μg／mL 马兜铃酸A 组细胞损伤太强，死亡太多，故选定10 μg／mL 马兜铃酸A 来刺激细胞。

表1 不同质量浓度马兜铃酸A 对HK⁃2 细胞存活率的影响（， n＝10）

表1 不同质量浓度马兜铃酸A 对HK⁃2 细胞存活率的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01。

3.2 6⁃姜酚对马兜铃酸A 诱导的HK⁃2 细胞存活率的影响 与正常组对比，10 μg／mL 马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞存活率降低（P＜0.01）；不同浓度6⁃姜酚处理后，HK⁃2 细胞凋存活率有不同程度的升高，在200 μg／mL 时最高，达到72%左右，故选取200 μg／mL。见表2。

表2 6⁃姜酚对马兜铃酸A 诱导的HK⁃2 细胞存活率的影响（， n＝10）

表2 6⁃姜酚对马兜铃酸A 诱导的HK⁃2 细胞存活率的影响（， n＝10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01。

3.3 6⁃姜酚对马兜铃酸A 诱导的HK⁃2 细胞形态的影响 与正常组相比，马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞数目减少；与马兜铃酸A 组相比，6⁃姜酚＋马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞数目增加。正常组细胞形态清晰，细胞体积饱满，细胞之间联系紧密；给药组细胞稍固缩，细胞间分散；与马兜铃酸A 组相比，6⁃姜酚＋马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞间分散度较小，饱满细胞的数目较多。见图1。

图1 各组HK⁃2 细胞形态（×100）

3.4 6⁃姜酚对马兜铃酸A 诱导的HK⁃2 细胞凋亡的影响 正常组HK⁃2 细胞几乎无凋亡，细胞核无分裂固缩形态；与正常组相比，马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞凋亡率升高（P＜0.01）；与马兜铃酸A 组相比，6⁃姜酚＋马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞凋亡率降低（P＜0.01）。见表3、图2。

表3 各组HK⁃2 细胞凋亡率（， n＝10）

表3 各组HK⁃2 细胞凋亡率（， n＝10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与马兜铃酸A 组比较，＃＃P＜0.01。

图2 各组HK⁃2 细胞凋亡（×100）

3.5 6⁃姜酚对马兜铃酸A 诱导的HK⁃2 细胞上清液中酶的影响 与正常组相比，马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞上清液中MDA、GSH⁃Px 水平升高（P＜0.01），SOD、GSH 水平降低（P＜0.01）；与马兜铃酸A 组相比，6⁃姜酚＋马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞上清液中MDA、GSH⁃Px 水平降低（P＜0.01），SOD、GSH 水平升高（P＜0.01）。见表4。

表4 各组HK⁃2 细胞上清液中酶水平（， n＝10）

表4 各组HK⁃2 细胞上清液中酶水平（， n＝10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与马兜铃酸A 组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 6⁃姜酚对马兜铃酸A 诱导的HK⁃2 细胞蛋白表达的影响 与正常组相比，马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞中p⁃NF⁃κB p65、cleaved⁃capase⁃3 蛋白表达升高（P＜0.01）；与马兜铃酸A 组相比，6⁃姜酚＋马兜铃酸A 组HK⁃2 细胞中p⁃NF⁃κB p65、Cleaved⁃Capase⁃3 蛋白表达降低（P＜0.01）。见图3。

图3 各组HK⁃2 细胞中蛋白表达（×100）

4 讨论

关木通曾在临床被广泛应用，在大量研究人员报道了其肾毒性后被限制使用。课题组早年对关木通进行了系统的综述［8］，详细总结了关木通的化学成分、药理学研究、临床应用及毒理学研究。既往研究也显示，关木通的不同炮制品中的马兜铃酸A 的含有量差异显著，且马兜铃酸A的水平与炮制品对大鼠肾脏功能的损伤有相关性［9⁃10］。

吴建红等［11］研究了导赤散配伍关木通对人肾小管上皮细胞周期的影响。陈燕玲等［12］通过6⁃姜酚保护由丙酮醛损伤的HK⁃2 细胞，发现6⁃姜酚具有保护HK⁃2 细胞减轻受损伤程度的作用。本研究结果显示，与马兜铃酸A 组相比，6⁃姜酚＋马兜铃酸A 组够显著升高HK⁃2 细胞的活性，改善细胞的形态，减少细胞凋亡的数目，降低细胞上清液中MDA 和GSH⁃Px 的水平，并增强上清液中SOD 和GSH 水平，降低HK⁃2 细胞内p⁃NF⁃κB p65 和Cleaved⁃Capase⁃3 蛋白表达，表明6⁃姜酚可能通过提高HK⁃2 细胞的抗氧化应激能力及抑制NF⁃κB 介导的炎症通路对抗马兜铃酸A 引起的HK⁃2 细胞损伤。由此表明，在使用含马兜铃酸的中药时，可给予干姜或其有效成分以降低患病风险，从而为关木通临床应用提供理论依据。