罗腾硕 郑中杰 张双伟 蒋顺进 杨馥桢 张 军∗

（1.广州中医药大学中药学院， 广东 广州510006； 2.广州医科大学附属第二医院心血管疾病研究所，广东 广州510260； 3.广东容大生物股份有限公司， 广东 清远511500）

连三叶处方为治疗外阴阴道假丝酵母菌病（Vulvovaginal Candidiasis，VVC）的临床验方，由黄连、三白草、大青叶、茶树油等药物组成［1⁃2］。方中君药黄连为治疗VVC 洗剂常用药味，其有效成分小檗碱易与酸性物质成盐，水溶性较差，如小檗碱盐酸盐在冷水中溶解度仅为2 mg／mL［3］，致使上市洗剂中或浓度甚低而抑菌效果差，或于制剂中易聚集、沉淀，影响制剂外观和疗效；茶树油是优良的天然抗菌精油［4］，亦难以直接溶于常规洗剂。

课题组前期已制备连三叶触变凝胶剂［1］，虽达到制剂载药量高目的，但小檗碱等黄连生物碱多以微粒形式分散于其中。微乳作为一种外观透明或半透明，各向同性的粒径小且均匀的热力学稳定体系［5］，对难溶性药物具有较好的溶解能力［6⁃7］。黄连生物碱和茶树油是连三叶方中两类抗真菌组分，水溶性均不佳，课题组设想以茶树油为油相制备微乳，可同时稳定承载方中两类药效物质。因此本实验开展连三叶微乳的制剂工艺研究，考察其理化性质，测定其中小檗碱含量且与上市制剂进行比较；白色念珠菌为VVC 的主要病原体［8］，我国大部分地区VVC 病原菌中白念珠菌所占的比例在70%～90%［9］，故通过以白色念珠菌为致病菌建立VVC 模型小鼠，评价连三叶微乳的药效。

1 材料

1.1 仪器 1260 Infinity Ⅱ液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ELELA SB⁃1000 旋转蒸发仪（上海爱明仪器有限公司）；AB204⁃N 分析天平（万分之一，瑞士梅特勒⁃托利多公司）；85⁃2A 数显恒温磁力搅拌器（常州澳华仪器有限公司）；Pilot3⁃6T 真空冷冻干燥机（北京博医康生物仪器有限公司）；KQ⁃400KDE 高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TG6⁃W 高速离心机（湖南湘宜实验室仪器开发有限公司）；Zetasizer Nano ZS 激光粒度仪（英国Malvern公司）；Talos F200 s 场发射透射电子显微镜（美国FEI 公司）；bsc⁃1100Ⅱb2 生物安全柜（山东博科科学仪器有限公司）；3870J 灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司）；PYX⁃DHS⁃35X⁃40 恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.2 试剂与药物 黄连（批号H3566214）、大青叶（批号4016511）、龙 胆（批 号 47815116 ）、百 部（批 号03415418）、苦 参（批 号 45445915）、鸡冠花（批 号J1016712）、丁 香（批 号 D4516412）、三白草（批 号82413657）、香薷（批号80565112）均购于广东省药材公司中药饮片厂，经广州中医药大学中药学院张军研究员鉴定为正品。茶树油（南宁万家辉香料有限公司，批号139＃）；蓖麻油聚氧乙烯醚（上海麦克林生化科技有限公司，批号C10097059）；1，2⁃丙二醇（天津大茂化学试剂厂，批号20171008）；曲拉通（上海阿拉丁试剂有限公司，批号l1813187）；聚氧乙烯40 氢化蓖麻油（德国巴斯夫有限公司，批号23660956P0）；卡波姆⁃940（上海麦克林生化科技有限公司，批号C10112075）；丙三醇（天津市津东天正精细化学试剂厂，批号20170617）；15⁃羟基硬脂酸聚乙二醇酯（北京凤礼精求商贸有限责任公司，批号54960875LO）；三乙醇胺（天津大茂化学试剂厂，批号20180117）；无水乙醇（天津市致远化学试剂有限公司）；聚乙二醇 300（上海阿拉丁试剂有限公司，批号H1524089）；羟乙基纤维素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号33766）；黄藤素（西安小草植物科技有限责任公司，批号XC20180401）；雌二醇油剂（哈尔滨市中大兽药有限责任公司，批号20180806）；4% 多聚甲醛溶液（中国biosharp 公司，批号1810473）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号1072401）；藻酸盐敷料（广州市科济医疗器械有限公司，批号042017002）。克霉唑阴道片（黑龙江诺捷制药有限责任公司，批号1707151）；洁尔阴洗液（四川恩威制药有限公司，批号1808094）。白色念珠菌 ［CMCC（F）98001］（中国药品生物制品检定所提供）。

1.3 动物 KM 小鼠由广东省医学实验动物中心提供，SPF 级，雌性，体质量14～16 g，实验动物生产许可证号SCXK（粤）2018⁃0002。

2 方法

2.1 方中小檗碱在表面活性剂和助表面活性剂中溶解能力

2.1.1 连三叶浓缩液制备 取黄连、三白草、大青叶、茶树油、龙胆、百部、苦参、鸡冠花、丁香、香薷适量，分别加6、4 倍量80% 乙醇回流提取2 次，1 h／次，滤过（200 目 筛），合并滤 液，减压浓缩至250 mL，即 得（0.62 g生药／mL），备用。

2.1.2 连三叶冻干粉制备 取适量“2.1.1” 项下连三叶浓缩液于西林瓶中，冻干机设置程序降温，1 h 从室温降至-40 ℃，维持5 h；升至-20 ℃开始抽真空（真空度2 000 kPa），维持22 h，升至20 ℃继续抽真空4 h，然后自动停止抽真空，取出样品，即得。

2.1.3 色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；以乙腈⁃0.05 mol／L 磷酸二氢钾溶液（50 ∶50）（每100 mL 中加入十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH 值为4.0）为流动相；检测波长345 nm；柱温30 ℃；体积流量0.6 mL／min。

2.1.4 方法耐用性试验 结合前期连三叶触变凝胶中小檗碱含量测定方法［10］，经专属性、精密度、重复性、稳定性、加样回收试验考察，表明本方法耐用性良好。

2.1.5 小檗碱溶解量测定 室温下，将过量连三叶冻干粉加入试管中，并分别加入5 mL 表面活性剂［蓖麻油聚氧乙烯醚（EL⁃35）、聚氧乙烯40 氢化蓖麻油（RH⁃40）、15⁃羟基硬脂酸聚乙二醇酯（HS15）、吐温⁃80（TW⁃80）、曲拉通（OP）、吐温⁃20（TW⁃20）］和5 mL 助表面活性剂［聚乙二醇300（PEG300）、1，2⁃丙二醇、丙三醇、无水乙醇］，密封后超声（功率280 W、频率40 kHz）处理20 min，再放入恒温振荡仪中，37 ℃下振摇24 h 后离心，分取上清液，用甲醇稀释适宜倍数后取出，微孔滤膜过滤，高效液相色谱法测定其中小檗碱含有量，判断其在不同溶剂中的溶解能力，结果见表1。

表1 小檗碱在不同溶剂中的溶解能力

根据上述结果，确定续以溶解能力较强的3 种表面活性剂（RH⁃40、OP、TW⁃20）、3 种助表面活性剂（无水乙醇、丙三醇、1，2⁃丙二醇），两两配伍而成混合表面活性剂，考察以茶树油为油相制备微乳的成乳性。

2.2 茶树油与混合表面活性剂的成乳性观察 分别将表面活性剂及助表面活性剂按质量比1 ∶1 配伍组成混合表面活性剂，再与茶树油按质量比9 ∶1 混合，磁力搅拌下滴加蒸馏水制备微乳，并以成乳后液体的澄明度、丁达尔效应、离心后是否分层为指标，观察各组分配伍的乳化情况，结果见表2。

表2 不同表面活性剂、助表面活性剂与茶树油配伍结果

初步观察显示，以1，2⁃丙二醇为助表面活性剂，RH⁃40、OP 为表面活性剂，或无水乙醇为助表面活性剂，RH⁃40、OP、TW⁃20 为表面活性剂组合而成的混合表面活性剂与茶树油可形成微乳。由于无水乙醇易挥发，所制备的微乳稳定性欠佳，故助表面活性剂选择1，2⁃丙二醇。

基于表面活性剂RH⁃40、OP，助表面活性剂1，2⁃丙二醇对小檗碱的溶解性较强，且与茶树油有较好的成乳性，续以伪三元相图中成乳面积为指标，考察表面活性剂种类及其与助表面活性剂比例（Km）。

2.3 表面活性剂种类的确定 将RH⁃40、OP 分别与1，2⁃丙二醇按质量比1 ∶1 混合，再分别与茶树油按质量比9 ∶1至1 ∶9混合，搅拌均匀，采用蒸馏水滴定法，绘制伪三元相图并筛选出最佳表面活性剂，结果见图1。由此可知，选择OP 作为表面活性剂时微乳区域面积更大。

图1 不同表面活性剂对微乳形成影响

2.4Km的确定 将OP 与1，2⁃丙二醇按Km1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、1 ∶2、1 ∶3 混合，再分别与茶树油按质量比9 ∶1～1 ∶9混合，搅拌均匀，采用蒸馏水滴定法，绘制伪三元相图，并筛选出最佳Km值，结果见图2。由此可知，Km值为2 ∶1 时微乳区域面积更大。

图2 不同Km 值对微乳形成影响

2.5 微乳构型的确定 将OP 与1，2⁃丙二醇按Km2 ∶1 混合，再分别与茶树油按质量比9 ∶1、12 ∶1、15 ∶1 混合，边滴加蒸馏水边测定电导率。由图3 可知，该微乳中含水量低于45%时，体系趋于油包水（W／O）状态；含水量高于63%时，体系趋于水包油（O／W）状态。

相比于W／O 型微乳，O／W 型微乳透皮效果更佳［11］，且临床顺应性更佳。因此，确定后续连三叶微乳中含水量不少于63%，制成O／W 型微乳。

2.6 连三叶微乳的制备及理化性质考察

2.6.1 连三叶微乳的制备 基于上述实验，选用OP 作为表面活性剂，1，2⁃丙二醇作为助表面活性剂，Km值为2 ∶1，且微乳体系中含水量不少于63%，拟定连三叶微乳生药量为0.4 g／mL，茶树油质量分数为3.0%，因此，确定连三叶微乳处方质量比为药液（0.62 g 生药／mL）∶茶树油∶OP ∶1，2⁃丙二醇＝24 ∶1.1 ∶8 ∶4。

图3 含水量与电导率变化曲线及O／W 微乳区域确定

2.6.2 连三叶微乳理化性质考察

2.6.2.1 稳定性试验 将连三叶微乳分别于13 000 r／min离心10 min、室温及4 ℃下放置3 个月，未出现沉淀或絮凝现象，提示制剂稳定性较佳。

2.6.2.2 粒径、Zeta 电位测定 以激光粒度仪测定连三叶微乳粒径及Zeta 电位，结果见表3、图4。

表3 连三叶微乳粒径及Zeta 电位（）

表3 连三叶微乳粒径及Zeta 电位（）

图4 连三叶微乳粒径（a）及Zeta 电位（b）

2.6.2.3 外观形态 将连三叶微乳稀释后滴于铜网上，静止20 min 待其充分吸附后用2% 磷钨酸溶液负染15 min，晾干后于电镜下观察，结果见图5，表明微乳呈类球形，表面无黏连。

表4 上市或医院制剂洗剂中小檗碱含有量测定结果

图5 连三叶微乳TEM 图

2.7 小檗碱含有量测定

2.7.1 色谱条件与系统适用性试验 同“2.1.2” 项下。

2.7.2 供试品溶液制备 取连三叶微乳约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇超声处理20 min，放冷，甲醇补重后精密量取3 mL 续滤液，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.7.3 样品含有量测定 连三叶微乳中小檗碱含量为3.38 mg／g，显著高于部分上市或医院制剂洗剂［12］，见表4。

2.8 连三叶微乳对VVC 模型小鼠的抗菌作用

2.8.1 菌种活化 取白色念珠菌，划线法接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，置于30～35 ℃恒温培养箱中培养2 d，挑取单个菌落（直径大于1 mm）接种到沙氏葡萄糖液体培养基中，于30 ℃、200 r／min 下振荡16 h 后，使其处于对数生长期。

2.8.2 VVC 模型小鼠构建 小鼠随机分分为空白组、模型组、连三叶微乳组、洁尔阴组、克霉唑组，每组10 只，每2 d 背部皮下注射雌二醇0.1 mL（0.1 mg／mL），共3 次（6 d）。末次注射后第2 天，除空白组外各组小鼠阴道接种白色念珠菌，每只1×108CFU／mL，24 h 后重复感染1 次。感染结束后次日取100 μL 生理盐水灌洗每只小鼠阴道，并回收于无菌EP 管中。将灌洗液稀释50 倍后，取50 μL 接种于新制的沙氏葡萄糖琼脂培养基上，35 ℃下培养48 h，观察菌株生长情况，计算菌落数，结果见表5。

表5 连三叶微乳对VVC 模型小鼠菌落数的影响（， n＝10）

表5 连三叶微乳对VVC 模型小鼠菌落数的影响（， n＝10）

注：与空白组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与洁尔阴组比较，▲P＜0.05。

2.8.3 VVC 模型小鼠给药与检测 模型组给予蒸馏水，给药组分别给予相应药液，用量均为50 μL，以藻酸盐敷料吸附后置于小鼠阴道，每次给药1 h 后取出藻酸盐敷料载体，每天2 次，连续21 d，于给药后第3、7、14、21 天取小鼠阴道灌洗液，测定白色念珠菌数量。100 μL 生理盐水灌洗每只小鼠阴道，并回收于无菌EP 管中，将灌洗液稀释50倍后取50 μL，接种于新制的沙氏葡萄糖琼脂培养基上，35 ℃下培养48 h，观察菌株生长情况，计算菌落数。实验结束后，取小鼠阴道组织进行病理观察，结果见图6。

图6 连三叶微乳对小鼠阴道组织的影响（PAS，×200）

2.8.4 统计学分析 应用SPSS 20.0 软件进行统计分析，各组菌落数为计量资料，以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

与空白组比较，模型组各时间点菌落数升高（P＜0.01），表明造模成功。给药后第3 天，连三叶微乳组菌落数相比模型组降低（P＜0.05），洁尔阴组与模型组菌落数相比差异无统计学意义（P＞0.05）；给药7、14、21 d 后，连三叶微乳组、洁尔阴组与模型组菌落数相比均降低（P＜0.01），连三叶微乳组菌落数与洁尔阴组相比更低（P＜0.05）。除模型组外，各给药组小鼠经治疗后体内均无明显菌丝（图6 中黑色箭头所指为白色念珠菌菌丝）。

3 讨论

本实验成功制备可同时溶解黄连生物碱和茶树油的微乳制剂，其中小檗碱含有量显著高于上市制剂，可为以黄连、黄柏等为主药治疗VVC 的洗剂工艺优化提供借鉴。

微乳包括W／O 型、双连续相型、O／W 型3 种构型，用于表征微乳构型的方法有：电导率法（EC）、流变法（Vis⁃cosity）、差式扫描量热法（DSC）、染色法（Staining Meth⁃od）、小角度中子散射法（SANS）等［13⁃15］。本实验通过测定不同含水量下微乳电导率的变化以表征其构型，在体系中含水量很少的时候，水位内相，油为外相，此时液滴数量很少，很难发生碰撞形成导电链；随着含水量增加，液滴的数量也增多，导电链逐渐形成，电导率逐渐上升（W／O型微乳形成阶段）；含水量继续增大，溶液处于油和水都为局部连续的过渡态，此时电导率处于缓慢上升阶段；但含水量增加到一定值时，可以导电的微粒被逐渐稀释，电导率开始下降［5，16］（O／W 型微乳形成阶段）。

药效学实验表明，连三叶微乳对VVC 模型小鼠药效优于洁尔阴，显示了其成药前景。