刘雅欣 贾 鹏 王 虹 徐桂红 林桂涛∗

（1.山东中医药大学， 山东济南250300； 2.齐鲁制药有限公司， 山东 济南250100； 3.齐河县人民医院，山东 德州251100）

黄芪主要含有多糖、皂苷、黄酮类成分［1］，其中多糖是其主要活性物质，具有抗感染、抗病毒、抗肿瘤等多种活性［2⁃5］，能增加T 淋巴细胞、B 淋巴细胞增殖分化［6］，具有显著的增加体液免疫、细胞免疫的作用［7］，该成分生物活性与其结构有密切关系。研究表明，黄芪多糖酸水解产生的小分子多糖可增加免疫［8］；李红法等［9］发现，乙醇分级沉淀该成分后不仅分子量有所差异，组成也明显不同，其中甘露糖、半乳糖、鼠李糖含有量降低，葡萄糖含有量升高，抗氧化作用增强。

目前，黄芪多糖注射液有人用［标准编号WS⁃330（Z⁃029）⁃2001］和兽用 ［标准编 号兽药 字（2013）220592711］，均作为免疫促进剂和调节剂，其中人用具有补气补虚功效，能用于免疫功能低下的肿瘤患者［10］，还可减少放化疗后不良反应发生［11］；兽用能诱导机体产生干扰素，促进抗体形成，在防治畜禽病毒性疾病中已成为用量最大的中药制剂［12］。黄芪多糖制备方法为黄芪加水煎煮提取，浓缩液加入乙醇至含醇量为50%，收集沉淀，加水溶解后再加入乙醇至含醇量为35%，除去沉淀，上清液干燥，即得，该方法保留了35%～50% 乙醇沉淀的多糖，但也损失了高体积分数乙醇沉淀者，该部位中多糖量可能更多，分子量可能更小，免疫增强作用可能更强。因此，本实验比较黄芪提取液用不同体积分数乙醇分级沉淀后黄芪多糖含有量、分子量和、免疫活性，以期为改进黄芪多糖注射液制备工艺奠定基础。

1 材料

1.1 动物 昆明种雄性小鼠，10 周龄左右，体质量15～20 g，购自山东朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号SCXK（鲁）20140007。

1.2 仪器 TDD5M 型高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；LDZX⁃50FBS 型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；EPOCH2T 型酶标仪（美国Bio⁃Tek 公司）；Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置InfinityⅡELSD 型检测器、LC1260 工作站（美国Agilent 公司）、Shodex OHpak SB⁃804 型高效凝胶色谱柱（日本昭和电工株式会社）；YP601N 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒⁃托利多公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗器械有限公司）。

1.3 试剂与药物 黄芪饮片购自安徽盛海堂中药饮片有限公司，经山东中医药大学徐凌川教授鉴定为豆科植物蒙古黄 芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根。印度墨水（北京索莱宝科技有限公司）；环磷酰胺（江苏盛迪医药科技有限公司）；注射用生理盐水；Sephadex G⁃100 型葡聚糖凝胶（北京酷来搏科技有限公司）；多糖对照品，分子量包括73 800 Da ［批号GBW（E）05006］、126 000 Da ［批号GBW（E）05007］、285 000 Da ［批号GBW（E）05008］、496 000 Da［批号GBW（E）05009］，均购自中国计量科学研究院，以及670 000 Da（批号9004⁃54⁃0），购自美国Sigma⁃Aldrich公司。其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 多糖制备及其含有量测定 称取饮片500 g，加水提取2 次，第1 次加10 倍量，第2 次加8 倍量，每次2 h，滤过，合并滤液，3 000 r／min 离心10 min，上清液浓缩至500 mL，加无水乙醇至含醇量为90%，静置12 h，滤过，沉淀加水溶解至500 mL，加无水乙醇至含醇量为90%，静置12 h，滤过，沉淀用无水乙醇、丙酮依次洗涤至无色，沉淀加水溶解，定容至500 mL，加入无水乙醇至含醇量为10%，置于4 ℃冰箱中静置12 h，3 000 r／min 离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤至无色，得10%乙醇沉淀的多糖（灰白色），上清液继续加无水乙醇至含醇量为35%，置于4 ℃冰箱中静置12 h，3 000 r／min 离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮洗涤至无色，得35%乙醇沉淀的多糖（灰白色）。同法得到50%、70%、90%乙醇沉淀的多糖，颜色分别为灰白色、棕色、棕色。

将不同体积分数乙醇沉淀的多糖在105 ℃下干燥3 h，再于玻璃干燥器中冷却30 min，称定粗多糖质量，各精密称取0.05 g，按照文献［13］报道的方法测定多糖含有量，结果见表1。由此可知，70%乙醇沉淀的粗多糖质量最大，其次是90%乙醇，但其纯度低于35%、50% 乙醇；70% 乙醇沉淀的多糖总量最高，几乎是其他部位的总和。

表1 粗多糖质量及多糖含有量测定结果

2.2 多糖分子量测定

2.2.1 多糖纯化 将10 g 已处理的Sephadex G⁃100 凝胶装柱（柱直径2.2 cm），吸取20 mg／mL 多糖溶液5 mL，以1 mL／min速度加入柱中平衡30 min 后开始洗脱，以3 mL为1 个收集单位。各精密吸取0.3 mL 至具塞试管中，加蒸馏水至2 mL，混匀，测定490 nm 波长处吸光度，绘制多糖流出曲线［14］，结果见图1。由此可知，不同体积分数乙醇沉淀的多糖在30 个单位时即可完全收集；除了70%乙醇沉淀的以外，其他部位多糖分子量接近，难以分离；70%乙醇沉淀的多糖明显分为2 个峰，表明至少有2 种分子量相差较大的多糖存在。

图1 多糖流出曲线

2.2.2 测定方法

2.2.2.1 色谱条件 Shodex OHpak SB⁃804 HQ 色谱柱；流动相纯水；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；进样量20 μL；Agilent 1260 Infinity ⅡELSD 检测器；喷雾温 度30 ℃；汽化温度90 ℃；载气N2，压力1.6 MPa。

2.2.2.2 对照品溶液制备 精密称取73 800、126 000、285 000、496 000、670 000 Da 葡聚糖对照品各6.00 mg，超纯水溶解至2 mL，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2.3 供试品溶液制备 精密量取“2.2.1” 项下4 个体积分数乙醇沉淀的多糖洗脱液各1 mL，置于5 mL 量瓶中，超纯水定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.2.4 线性关系考察 取对照品溶液20 μL，在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图2。以不同分子量葡聚糖保留时间为横坐标（X），葡聚糖分子量对数值为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝-0.535 2X＋8.560 6（R2＝0.995 3），在73 800～670 000 Da 范围内呈良好的线性关系。

图2 葡聚糖凝胶色谱图

2.2.2.5 精密度试验 吸取分子量73 800 Da 的对照品溶液，在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得保留时间RSD 为2.38%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 结果 吸取供试品溶液适量，在“2.2.2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图3。由此可知，除了70%乙醇沉淀的多糖外，其他部位均为以1 个主要分子量多糖为主的混合物，其他分子量多糖较少；根据保留时间计算，70%乙醇沉淀的多糖存在3 个主要成分，分子量分别为485 000、394 000、119 000 Da，而其他 部位分别为543 000 Da（35%乙醇）、496 000 Da（50%乙醇）、168 000 Da（90%乙醇），表明乙醇体积分数越高，多糖分子量越小。

2.3 黄芪多糖对小鼠免疫功能的影响

2.3.1 注射液制备 黄芪多糖加注射用水溶解，配制成0.01 mg／mL（按葡萄糖计）溶液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，滤液灌封（2 mL 安瓿），121 ℃下灭菌30 min，即得。

2.3.2 分组及给药 小鼠按照质量均衡和随机分配的原则分为8 组，即空白组、未分级沉淀组、10% 乙醇沉淀组、35%乙醇沉淀组、50%乙醇沉淀组、70%乙醇沉淀组、90%乙醇沉淀组、造模组，每组11 只，除空白组外其余各组小鼠每天腹腔注射环磷酰胺溶液（精密称取环磷酰胺0.2 g，加入20 mL 生理盐水溶解，3 000 r／min 离心，上清液过0.45 μm 微孔滤膜过滤，滤液按每瓶2 mL 的规格注入安瓿中，封口，121 ℃下灭菌）0.1 mL（40 mg／kg），连续3 d，再腹腔注射0.5 mL 供试品溶液，而空白组小鼠腹腔注射0.5 mL 生理盐水，连续10 d。

2.3.3 指标检测 末次给药1 h 后，将25% 印度墨水按0.1 mL／10 g 剂量注入小鼠尾部静脉，于给药1、5 min（t1、t2）后在右内眦静脉取血各20 μL，加到3 mL 0.1%Na2CO3溶液中混合均匀，置于96 孔细胞培养板上（每组3 个复孔），在570 nm 波长处分别测定光密度值（OD1、OD2），计算碳粒廓清指数K，公式为。再将小鼠颈椎脱臼处死，取出肝脏和脾脏，称定质量，计算吞噬系数α、脾指数，公式分别为脾指数＝，平均脾指数＝。通 过SPSS 软件进行统计学处理，组间两两比较采用LSD⁃t检验，组内比较采用Dunnett⁃t检验，结果见表2。

表2 黄芪多糖对小鼠脾指数、吞噬系数的影响（， n ＝11）

表2 黄芪多糖对小鼠脾指数、吞噬系数的影响（， n ＝11）

注：与模型组比较，∗P ＜0.05；与空白组比较，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01。

由此可知，与空白组比较，模型组小鼠脾脏指数、吞噬指数降低（P＜0.05），表明造模成功；各乙醇沉淀组脾指数升高（P＜0.01），以70%乙醇最明显，其次是50%乙醇；50%、70%乙醇沉淀组吞噬系数升高（P＜0.05），90%乙醇沉淀组降低（P＜0.05）。

图3 多糖凝胶色谱图

4 讨论与结论

前期曾采用Sevage 法去除黄芪多糖中蛋白质，发现去除前其质量分数分别为0.68 mg／g（10% 乙醇沉淀）、0.71 mg／g（35%乙醇沉淀）、0.79 mg／g（50%乙醇沉淀）、0.96 mg／g（70%乙醇沉淀）、0.66 mg／g（90%乙醇沉淀），而去除后分别为0.55、0.59、0.61、0.65、0.57 mg／g，可知黄芪多糖中原有蛋白质含有量较低，即使将其去除也对测定结果无明显影响，故本实验未进行相关处理。另外，多糖中游离单糖可影响其含有量测定，故本实验采用无水乙醇、丙酮洗涤的方法进行处理，硫酸⁃蒽酮法检测洗涤液时发现，黄芪多糖中已无游离的还原性单糖。

结果显示，黄芪多糖主要存在于50%、70%、90%乙醇沉淀的多糖中，以70%乙醇沉淀时总量最高，而35%以下（包括35%）乙醇沉淀时较低，可知原制备工艺最高醇沉浓度为50%时会损失大部分多糖。另外，70%乙醇沉淀时有3种分子量相差较大的多糖，而其他体积分数乙醇沉淀时都显示仅有1 种；随着乙醇体积分数升高，黄芪多糖分子量降低（但在10%时对黄芪多糖免疫活性的贡献较小，故未测定其分子量），其中50%、70%乙醇沉淀时3 种多糖中含有量较高（保留时间5.686 0 min 左右）者的分子量相近，均以480 000～500 000 Da 为主。

黄芪多糖分子量越低，免疫活性越强，但90%乙醇沉淀时其分子量显著降低，免疫活性也明显减弱。综合脾指数、吞噬系数可知，不同体积分数乙醇沉淀的黄芪多糖均有增强免疫活性的作用，程度依次为70%乙醇＞50%乙醇＞35%乙醇≈10%乙醇＞90%乙醇，推测可能与该成分分子量主要在480 000～500 000 Da 之间有关。

由此建议，将黄芪多糖制备工艺改进为黄芪提取浓缩液加乙醇至含醇量为70%，静置12 h 后除去上清液，沉淀加水搅拌至溶解，加乙醇至含醇量为35%，静置后除去沉淀，上清液干燥。