江美芳 高 崎 王丹丹

（上海上药杏灵科技药业股份有限公司， 上海201210）

银杏叶是我国传统中药，其成分主要包括黄酮、萜内酯、烷基酚、羧酸等，其中黄酮、萜内酯是主要活性物质［1⁃2］。银杏酮酯（GBE50）是新一代银杏叶提取物，总黄酮、萜内酯类质量分数可提高到50%以上，临床上被广泛用于治疗血瘀型胸痹及血瘀型轻度脑动脉硬化引起的眩晕、冠心病、心绞痛等心血管疾病［3⁃4］。

体外溶出度是模拟口服固体制剂在胃肠道中的崩解和溶出情况、评价制剂活性成分的生物利用度和药物质量的内在指标［5⁃6］，目前常见评价方法主要以单一［7］或多种［8］成分为指标进行体外溶出度研究［9⁃10］，难以反映中药组分的整体体外溶出情况。近年来，研究人员提出质量权重系数法来研究中药多组分溶出度［11⁃12］，从而反映中药整体溶出，但目前国家标准中银杏酮酯片只有崩解时限的检测，尚未涉及其溶出度。因此，本实验通过质量权重系数法来研究银杏酮酯片多组分整合溶出度以表征该制剂整体溶出情况，以期为其质量标准提升奠定基础，也为中药制剂体内外释放评价和整体性质研究提供新的思路和参考。

1 材料

Waters Xevo G2⁃XS Q⁃TOF·ESI 液质联用仪（美国Waters 公司）；Rcz 6C3 溶出度仪（上海黄海药检仪器有限公司）；FE28 PH 计（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；SQPQUINTIX65⁃1CN 电子分析天平（德国Sartorius 公司）。银杏内酯A（批号W25A7K13730）、银杏内酯C（批号C28S6G3986）、白果内酯（批号P08J9F52398）、芦丁（批号 Y16M9S61523 ）、异鼠李 素⁃3⁃O⁃葡萄糖（批 号Y09J9H52567 ）、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖（批 号Y15N8H48277）、香蒲新苷（批号Y1458H43976）对照品（上海源叶生物科技有限公司）；银杏内酯B 对照品（批号110863⁃201611，中国食品药品检定研究院）；异槲皮苷对照品（批号2183／17872，上海诗丹德生物技术有限公司）。银杏酮酯片（批号171002，上海上药杏灵科技药业股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 萜内酯、黄酮苷含有量测定

2.1.1 UPLC⁃MS 条件

2.1.1.1 色谱 Waters AcQuityTMUPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸（A）⁃甲醇（B），梯度洗脱（0～10 min，98%～25% A；10～10.5 min，25%～2% A；10.5～13 min，2% A；13～13.5 min，2%～98%A；13.5～15 min，98% A）；体积流量0.4 mL／min；柱温45 ℃；进样量1 μL。

2.1.1.2 质谱 电喷雾离子源（ESI），负离子条件下采用Sensitivity 模式，扫描时间15 min；毛细管电压2.5 kV；离子源温度120 ℃，脱溶剂气体积流量800 L／h，温度400 ℃；锥孔电压35 V；萃取电压4.0 V。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖、香蒲新苷对照品适量，二甲基亚砜制成各成分质量浓度约为1 mg／mL 的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取片剂20 片，研磨成粉，称取100 mg，5 mL 50%甲醇超声提取10 min，10 000 r／min 离心10 min，取上清液，重复3 次，合并上清液，用50% 甲醇定容至25 mL 量瓶中，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液适量，50%甲醇稀释成系列质量浓度，在“2.1.1” 项条件下各进样1 μL 测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.1.5 专属性试验 根据片剂处方称取空白辅料适量，按比例制成阴性制剂，再按“2.1.3” 项下方法制备阴性样品溶液。取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1.1” 项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分之间互不影响，辅料无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分提取离子流色谱图

2.1.6 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1.1” 项条件下进样测定6 次，测得各成分峰面积RSD 分别为银杏内酯B 2.63%、银杏内酯A 2.42%、银杏内酯C 2.20%、白果内酯1.98%、芦丁1.26%、异槲皮苷1.59%、异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖1.55%、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖1.37%、香蒲新苷1.39%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取样品溶液6 份，于0、2、4、8、12 h在“2.1.1” 项条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD 分别为银杏内酯B 2.89%、银杏内酯A 2.46%、银杏内酯C 3.06%、白果内酯2.40%、芦丁2.55%、异槲皮苷2.54%、异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖2.05%、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖2.13%、香蒲新苷2.20%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 取片剂适量，按“2.1.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项条件下进样测定，测得各成分含有量RSD 分别为银杏内酯B 1.69%、银杏内酯A 1.69%、银杏内酯C 2.18%、白果内酯2.45%、芦丁1.12%、异槲皮 苷1.06%、异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖3.40%、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖1.41%、香蒲新苷3.82%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 测定结果 取 “2.1.3” 项下供试品溶液，在“2.1.1” 项条件下进样测定，计算含有量。结果，每片中各成分含有量RSD 分别为银杏内酯B 0.21%、银杏内酯A 0.47%、银杏内 酯C 0.16%、白果内 酯0.72%、芦 丁0.44%，异槲皮苷0.11%，异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖0.012%、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖0.29%、香蒲新苷0.054%。

2.2 溶出度测定 取片剂6 片，采用2015 年版《中国药典》 附录溶出度测定第二法桨法，将其置于溶出仪中，以500 mL 缓冲液（pH ＝1.2）为溶出介质，转速100 r／min，温 度37 ℃，平 行5 份，在5、15、30、45、60、90、120 min各取样3 mL，3 mL 空白缓冲液补足体积，溶出液在6 000 r／min 下离心10 min，取上清液，缓冲液稀释10倍，作为样品溶液，在“2.1.1” 项条件下进样测定，计算溶出度，绘制累积释放曲线，结果见图2。由此可知，在30 min 时银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖、香蒲新苷溶出度分别为96%、94%、94%、100%、99%、93%、97%、97%、104%，表明其溶出性良好。

图2 萜内酯、黄酮苷累积释放曲线

2.3 溶出曲线整合模型建立 本实验引入以质量分数为指标的权重系数［13⁃14］，选择成分质量分数作为整体单位，权重系数为各成分、总成分质量分数的比值。假设总成分中有n种成分，质量分数分别为a、b、c、d…，总成分质量分数为ω，各成分权重系数ψ、组分整体性质值δ计算公式分别为ψ＝n／ω＝100%，其中A、B、C…代表各成分性质值。结果，银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖、香蒲新苷权重系数 分别为0.085、0.191、0.065、0.292、0.178、0.045、0.005、0.118、0.022。

将每个时间点各成分累积溶出度赋以相应权重系数，计算其整合累积溶出度，并绘制整合溶出曲线，结果见图3。由此可知，片剂整体溶出性较好，在30 min 时溶出度达到97.97%，与各成分本身溶出行为相似。

图3 片剂整合溶出曲线

2.4 溶出曲线相似性分析 近年来，f2相似因子法作为定量描述体外溶出曲线相似性的非模型依赖方法［15⁃16］，因其计算简单、判定方法可靠，已被美国FDA 的CDER（药品评价和研究中心）和欧盟的EMEA（欧盟药品审评局）推荐使用［17⁃18］，广泛用于受试试剂与参比制剂之间的溶出曲线相关性研究［19］。f2＝50lg其中Ri、Ti分别为参比制剂、受试制剂在各时间点的释放度，n为时间点个数，对于2 条溶出曲线而言，如果其f2≥50，则认为两者相似，反之则不相似。结果，银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯C、白果内酯、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖、香蒲新苷f2分别为77、77、74、70、76、64、70、77、55，表明整合溶出曲线与各成分溶出曲线均相似，相关性良好，可客观反映片剂整体溶出情况。

3 讨论与结论

银杏酮酯片在模拟胃酸的pH 1.2 缓冲液中30 min 时，其所含各成分溶出度及整合溶出度均达到90%以上，即在该缓冲液中能较快溶出。再通过f2相似因子法进行验证，发现整合溶出曲线与各单体成分溶出曲线具有较好的相关性，能反映银杏酮酯片体外整体溶出情况。

将银杏酮酯片分别置于pH1.2、pH4.5、水（pH6.4）、pH8.0 的溶出介质中20 min 时发现，该制剂在碱性条件下溶出度小，而在酸性条件下溶出度大，故选择pH 为1.2；分别在50、75、100 r／min 下处理20 min 时发现，它在100 r／min下溶出度最大，故选择其作为转速。另外，在桨法溶出度研究中常用溶出体积有500、900、1 000 mL［20⁃22］，本实验经考察后选择500 mL。

通过UPLC⁃Q⁃TOF／MS 法对银杏酮酯片50%甲醇提取液进行分析，发现芦丁、异槲皮苷、异鼠李素⁃3⁃O⁃葡萄糖、山柰酚⁃3⁃O⁃芸香糖、香蒲新苷含有量相对较高，苷元包括槲皮素、异鼠李素、山柰酚，苷包括单糖、双糖、三糖苷，基本覆盖了黄酮苷绝大部分构型；银杏内酯A、B、C 及白果内酯为萜内酯中的主要有效成分，含有量也较高。因此，本实验选择上述成分作为指标。

目前，主要通过HPLC 法（配置ELSD、UV 检测器）检测萜内酯、黄酮醇；本实验采用LC⁃MS 法同时测定上述2 种成分的含有量，可简化样品前处理过程，减少分开检测的繁琐程序，并且能增加灵敏度，避免成分因其溶出度低而未被检测出或引起较大误差。