夏 倩 尚 强 张润容 胡 坪 欧阳 胜 章弘扬∗

（1.华东理工大学化学与分子工程学院， 上海200237； 2.丽珠医药集团股份有限公司， 国家中药现代化工程技术研究中心， 广东 珠海519090； 3.江西中医药大学药学院， 江西 南昌330004）

僵蚕是蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus 4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana（Bals.）Vuilknt 而致死的干燥体［1］，具有祛风定惊、化痰散结、美容养颜的功效。僵蚕虽然被收录于2015 年版《中国药典》，同时该药材及其制剂在临床上已被广泛应用［2⁃4］，但其化学、药效成分并不明确，因此建立可靠的质量评价手段具有重要意义。

白僵菌素是家蚕感染白僵菌过程中产生的代谢产物［5］，是家蚕感染白僵菌的特有成分及重要判断依据，具有抗菌［6⁃7］、抗癌［8⁃9］作用，因此可作为僵蚕的质量评价指标，具有较强的专属性。它是环状三羧酸肽、弱极性化合物，分子式为C45H57N3O9，目前常用液相色谱⁃紫外检测法（LC⁃UV）测定其含有量［10⁃11］，但存在灵敏度低、选择性差等不足。近年来，液相色谱与质谱联用技术（LC⁃MS）凭借其高灵敏度、高选择性等优势，在中药成分含有量测定中被广泛应用［12⁃13］，本研究基于超高效液相色谱⁃四极杆⁃飞行时间质谱（UH⁃PLC⁃Q⁃TOF⁃MS）技术建立僵蚕及其制剂中白僵菌素含有量的测定方法，并对不同批样品进行质量评价。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290 超高效液相色谱⁃6530 四极杆⁃飞行时间质谱仪，配置二元高压梯度泵、可控温自动进样器、可控温柱温箱、二极管阵列检测器和电喷雾离子源（美国安捷伦公司）；电子天平（万分之一，瑞士梅特勒⁃托利多公司）；KQ⁃500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲醇（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）；屈臣氏蒸馏水（北京屈臣氏蒸馏水有限公司）。白僵菌素对照品（批号419469，纯度99%，北京百灵威科技有限公司）。13 批僵蚕（S1～S13）由丽珠医药集团研究院中药研究所收集提供，经国家中药现代氏工程技术研究中心张润容博士鉴定为家蚕Bombyx moriLinnaeus 4～5 龄的幼虫感染白僵菌而致死的干燥体。天蚕片（S14，山西仁源堂药业有限公司）；小儿七珍丸（S15，朗致集团双人药业有限公司）；小儿葫芦散（S16，太原大宁堂药业有限公司）。

2 方法

2.1 精密对照品溶液制备 称取白僵菌素对照品适量，80%甲醇溶解并定容至10 mL，得到贮备液，取适量用80% 甲醇稀释成不同质量浓度（47.6、23.8、11.9、2.4、0.48、0.1 μg／mL）溶液，即得，均置于4 ℃下冷藏备用。

2.2 供试品溶液制备 将药材及制剂粉碎，过40 目筛，称取粉末约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80% 甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声（40 kHz、500 W）提取30 min，放冷，80% 甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.1 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 Agilent Eclipse Plus C18UHPLC 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相乙腈⁃水（70 ∶30）；体积流量0.3 mL／min；柱温45 ℃；检测波长215 nm；进样量0.2 μL。

2.4 质谱条件 采用电喷雾离子源，在TOF 模式下分别进行正离子全扫描，采集一级质谱数据；雾化气温350 ℃；雾化器体积流量10 L／min；雾化气压30 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；毛细管电压3 500 V；撇除器电压65 V；八极杆射频电压750 V；毛细管出口电压125 V。质量扫描范围m／z50～1 500。选择参比溶液中的2 个内标离子m／z121.050 9、922.009 8，对质量测定结果进行实时校正。

2.5 样品测定 取13 批药材及3 批制剂，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在 “2.3”“2.4” 条件下进样测定，记录LC⁃UV 和总离子流图。质谱数据采用Agilent MassHunter 软件处理。

3 结果

3.1 白僵菌素测定方法建立 按“2.2” 项下方法下制备供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，代表性药材（S4）中白僵菌素［M ＋Na］＋提取离子流图（EIC）、LC⁃UV 图及制剂（小儿七珍宝）LC⁃UV 图见图1。如图1A 所示，白僵菌素分离度良好，峰型对称，质谱响应高于紫外检测，而且杂质无干扰。

图1 各样品色谱图Fig.1 Chromatograms of various samples

3.2 方法学考察

3.2.1 精密度试验 精密称取0.5 g 药材粉末（S4）1 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下连续进样测定6 次，测得白僵菌素含有量RSD 小于3.0%，表明仪器精密度良好。

3.2.2 重复性试验 精密称取0.5 g 药材粉末（S4）6 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，测得白僵菌素含有量RSD 小于2.9%，表明该方法重复性良好。

3.2.3 稳定性试验 精密称取0.5 g 药材粉末（S4）1 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下0、1、2、4、8、12 h进样测定，测得白僵菌素含有量RSD 小于3.1%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

3.2.4 线性关系考察 取不同质量浓度对照品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定。以白僵菌素峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为Y＝4.06×105X＋2.30×105（R2＝0.999 2），在0.1～47.6 μg／mL 范围内线性关系良好。

3.2.5 加样回收率试验 精密称取药材粉末（S4）5 份，精密加入适量对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 白僵菌素加样回收率试验结果（n＝5）Tab.1 Results of recovery tests for beauverin（n＝5）

3.3 样品含有量测定 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，得到TIC 图。通过EIC 提取［M＋Na］＋（m／z806.402 5），外标法计算含有量，结果见表2。

表2 白僵菌素含有量测定结果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of beauverin（mg／g）

4 讨论

4.1 条件优化 本实验分别对提取方式（超声、回流）、提取溶剂（水，20%、40%、60%、70%、80%、90%甲醇，纯甲醇）、提取时间（10、20、30、40、60 min）、溶剂体积（5、10、20、25、50 mL）进行考察，发现当甲醇体积分数低于40%时，白僵菌素未能被提取出来，这是由于该成分具有较强的亲脂性［14］。最终确定，最佳提取方法为0.5 g 僵蚕粉末加入10 mL 80% 甲醇，超声提取30 min。

4.2 定量方法考察 高分辨质谱测定时发现，白僵菌素在正离子模式下可生成［M＋H］＋、［M＋Na］＋、［M＋NH4］＋、［M＋K］＋等加合离子，其中［M＋Na］＋响应最高且信号强度稳定，因此选择其进行定量。白僵菌素由于共轭基团较少，为紫外末端吸收，故利用LC⁃UV 法测定时背景干扰较大；当其含有量较低时，紫外响应过小，难以准确定量；本研究测得检测限、定量限分别是0.1、0.3 μg／mL，因此LC⁃MS 法具有更高的灵敏度。此外，由于制剂样品中基质复杂，常规LC⁃UV 方法难以实现白僵菌素与相邻杂质干扰物的基线分离，见图2，而LC⁃MS 方法具有良好的选择性，能将其分离并准确测定。

4.3 定量结果分析 13 批药材中白僵菌素质量分数为0.045～0.723 mg／g，RSD 为28.0%，即不同产地和批次僵蚕差异较大。其中，四川产僵蚕中白僵菌素含有量相对较高，而广西产相对较低，最低仅为0.045 mg／g（广西宜宾），而且炮制过的更低。此外，3 批制剂中白僵菌素含有量更低（0.015～0.026 mg／g），利用本研究所建立的方法进行测定时更具优势。