洪 萌 李权达 石荣先

（河南大学第一附属医院眼科， 河南 开封475000）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常见的微血管并发症之一，是患者致盲的重要原因之一，严重影响患者的健康和生活质量［1］，近年来，中医药对DR 的治疗取得了一定的疗效，可从多环节、多靶点防治［2］。异甘草素是甘草中的异黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用，适宜剂量下可保护糖尿病心肌病大鼠，维持心肌功能、代谢及心肌细胞结构正常［3］，在体外能够抑制骨肉瘤细胞MG⁃63 的增殖与侵袭［4］；甘草黄酮可以抑制高糖诱导的人眼视网膜上皮细胞氧化损伤及凋亡的发生，预防糖尿病性视网膜病变［5］。血管内皮细胞生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）为VEGF 家族成员之一，是与微血管新生功能相关的生长因子，与DR 的发生发展密切相关［6］，高迁移率族蛋白A1（high mobility group protein A1，HMGA1）通过下调VEGFA 表达来预防糖尿病性视网膜增生［7］，有研究发现中药联合激光降低DR 患者VEGF 水平可延缓糖尿病视网膜病变的病情发展［8］；核因子⁃κB（Nuclear factor κB，NF⁃κB）信号通路也与DR的发生有关，可阻断该信号通路对糖尿病大鼠视网膜起保护作用［9］，异甘草素能通过抑制NF⁃κB 信号通路抑制人肺癌H460 细胞的增殖和诱导细胞周期阻滞，并促进其凋亡［10］。然而，异甘草素对糖尿病视网膜病变的影响及其机制是否与VEGFA 和NF⁃κB 信号通路有关还尚未清楚。本实验用高糖处理人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 建立糖尿病视网膜病变模型，研究异甘草素对高糖诱导的ARPE⁃19细胞增殖和迁移的影响及其机制与VEGFA 和NF⁃κB 信号通路的关系。

1 材料

1.1 细胞 人视网膜上皮细胞系ARPE⁃19，购自美国菌种保藏中心（ATCC）。

1.2 试剂与药物 DMEM／F12 培养基（货号SH30243.01）、胎牛血清（货号SV30087.02）、胰蛋白酶（货号SH30042.01）购自美国Hyclone 公司；葡萄糖（货号G116304）购自河北圣雪葡萄糖有限公司；异甘草素（货号B21525⁃20 mg，纯度98%）购自上海源叶生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒（货号C0009）、二辛可宁酸（BCA）试剂盒（货号P0012S）、ECL化学发光液（货号P0018S）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）（货号FFP39）、十二烷基硫酸钠、钠盐⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳（dodecyl sulfate，sodium salt⁃Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS⁃PAGE）试剂盒（货号P0690）购自碧云天生物技术研究所；MMP2（货号250752）、MMP9（货号250755）抗体购自美国Abbiotec 公司；VEGFA（货号PL0502017）、Cyclin D1（货号PL0502539）购自加拿大Pllabs 公司；p⁃p65（货号HZ⁃22488）购自美 国Santa 公 司；p⁃IκBα 一抗抗体（货号bs⁃18128R⁃2）购自上海玉博生物科技有限公司；山羊抗兔IgG⁃HRP（货号AAT⁃16793）购自美 国 AAT Bioquest 公 司；Transwell 小室（货号353090）购于美国BD 公司；LipofectamineTM 2000 转染试剂盒（货号11668⁃027）美国Invitrogen 公司；荧光定量试剂盒（货号218073）购自德国Qiagen 公司；载体质粒购自北京普瑞金科技有限公司。

1.3 仪器 Thermo FC 酶标仪购自美国Thermo 公司；LightCycler480 荧光定量PCR 仪购自上海仁科生物科技有限公司；荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司。

2 方法

2.1 细胞培养 人视网膜上皮细胞系ARPE⁃19 常规培养于含10%胎牛血清的DMEM／F12 培养基中，于含5% CO2的37 ℃恒温箱中培养，每1～2 d 换1 次新鲜培养液，细胞融合至90%左右时进行消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 细胞处理与分组 取正常培养细胞于6 孔板培养，细胞贴壁且状态良好时更换为葡萄糖浓度为25 mmol／L 的培养基继续培养24 h，作为高糖组；取正常培养的细胞，作为对照组；用浓度分别为30、60、120 μmol／L 的异甘草素处理ARPE⁃19 细胞24 h，再用25 mmol／L 的葡萄糖处理24 h，作为不同浓度异甘草素处理组；将si⁃con、si⁃VEGFA 转染至ARPE⁃19 细胞后用25 mmol／L 葡萄糖处理24 h，作为高糖＋si⁃con 组、高 糖＋si⁃VEGFA 组；将pcDNA⁃con、pcDNA⁃VEGFA 转染至ARPE⁃19 细胞后用60 μmol／L的异甘草素处理24 h，再用25 mmol／L的葡萄糖处理24 h，作为高糖＋异甘草素＋pcDNA⁃con 组、高糖＋异甘草素＋pcDNA⁃VEGFA 组。

2.3 MTT 试剂盒检测细胞存活率 各组细胞培养48 h 后，分别加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，在37 ℃培养箱中孵育4 h，吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO 振荡反应15 min，酶标仪检测490 nm波长处光密度（OD），细胞存活率＝（OD实验组／OD对照组）×100%。实验重复3 次，每次3 个复孔。

2.4 Western blot 检测蛋白表达 各组细胞培养48 h后提取总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取50 μg 总蛋白，经10%聚丙烯酰胺凝胶转至PVDF上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，再分别加入一抗（MMP2、MMP9、VEGFA、CyclinD1、p⁃p65、p⁃IκBα），4 ℃孵育过夜，Tris 盐吐温缓冲液（Tris Buffer Solution Tween，TBST）洗膜，加入二抗室温孵育90 min，TBST 洗涤3 次，ECL 化学发光液显像，Quantity One 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的灰度值，蛋白相对表达量＝目的条带灰度值／β⁃actin 条带灰度值。每个蛋白样品重复3 次。

2.5 Transwell 实验检测细胞迁移 取200 μL 细胞悬液种于Transwell 小室上室，下室加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM／F12 培养液，37 ℃培养24 h后用4% 多聚甲醛固定，再用0.1% 结晶紫染色，显微镜观察并随机选取5 个视野拍照计数，计算结晶紫染色细胞数，即为迁移细胞数。

2.6 RT⁃PCR 检测VEGFAmRNA 表达 各组细胞培养48 h 后提取总RNA，再反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品3 个重复，反应总体系20 μL，其中SYBR 9 μL，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，H2O 9.5 μL。循环条件为95 ℃3 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 个循环，60 ℃延长5 min，相对表达量用2-△△ct计算。以β⁃actin 为内参，VEGFA正向5′⁃CCAGCAGAAAGAGGAAAGAGGTAG⁃3′，反向5′⁃CCCCAA AAGCAGGTCACTCAC⁃3′；β⁃actin 正向5′⁃CTCCATCCTGGCCTCGCTGT⁃3′，反向5′⁃GCT⁃GTCACCTTCACCGTTCC⁃3′。

2.7 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，计量资料以（）表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度异甘草素对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖的影响 与对照组比较，葡萄糖处理后人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 的存活率升高（P＜0.05）；与高糖组比较，不同浓度异甘草素组人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 的存活率降低（P＜0.05），见表1。

表1 不同浓度异甘草素对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖的影响（， n＝9）Tab.1 Effects of isoliquiritigenin at different concentrations on the proliferation of ARPE⁃19 cells（， n＝9）

表1 不同浓度异甘草素对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖的影响（， n＝9）Tab.1 Effects of isoliquiritigenin at different concentrations on the proliferation of ARPE⁃19 cells（， n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与高糖组比较，＃P＜0.05。

3.2 不同浓度异甘草素对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 迁移的影响 与对照组比较，葡萄糖处理后人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中MMP2、MMP9表达和迁移细胞数升高（P＜0.05）；与葡萄糖处理组比较，不同浓度异甘草素组人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中MMP2、MMP9 表达和迁移细胞数降低（P＜0.05），见表2、图1。

表2 不同浓度异甘草素对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 迁移的影响（， n＝9）Tab.2 Effectsof isoliquiritigenin at different concentrations on the migration of ARPE⁃19 cells（， n＝9）

表2 不同浓度异甘草素对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 迁移的影响（， n＝9）Tab.2 Effectsof isoliquiritigenin at different concentrations on the migration of ARPE⁃19 cells（， n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与高糖组比较，＃P＜0.05。

图1 不同浓度异甘草素对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 迁移的影响Fig.1 Effects of isoliquiritigenin at different concentrations on migration of ARPE⁃19 cells

3.3 异甘草素对VEGFA 表达的影响 与对照组比较，葡萄糖处理后人视网膜上皮细胞ARPE⁃19中VEGFA 蛋白和mRNA 表达升高（P＜0.05）；与高糖组比较，高糖＋60 μmol／L 异甘草素组人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中VEGFA 蛋白和mRNA 表达降低（P＜0.05），见图2、表3。

图2 Western Blot 检测VEGFA 蛋白表达Fig.2 Detection of VEGFA protein expression by Western blot

3.4 低表达VEGFA 对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖和迁移的影响 与对照组比较，葡萄糖处理后人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 表达，细胞存活率和迁移细胞数升高（P＜0.05）；与高糖＋si⁃con 组比较，高糖＋si⁃VEGFA 组人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 表达，细胞存活率和迁移细胞数降低（P＜0.05），见图3、表4。

表3 异甘草素对VEGFA 表达的影响（， n＝9）Tab.3 Effect of isoliquiritigenin on VEGFA expression（， n＝9）

表3 异甘草素对VEGFA 表达的影响（， n＝9）Tab.3 Effect of isoliquiritigenin on VEGFA expression（， n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与高糖组比较，＃P＜0.05。

图3 Western blot 检 测VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表达（Ⅰ）Fig.3 Detection of VEGFA，CyclinD1，MMP2 and MMP9 protein expressions by Western blot（Ⅰ）

3.5 高表达VEGFA 可以部分逆转异甘草素对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖和迁移的抑制作用与高糖组比较，高糖＋异甘草素组人视网膜上皮细 胞 ARPE⁃19 中 VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 表达，细胞存活率和迁移细胞数降低（P＜0.05）；与高糖＋异甘草素＋pcDNA⁃con 组比较，高糖＋异甘草素＋pcDNA⁃VEGFA 组人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 表达，细胞存活率和迁移细胞数升高（P＜0.05），见图4、表5。

表4 低表达VEGFA 对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖和迁移的影响（， n＝9）Tab.4 Effects of low VEGFA expression on the proliferation and migration of ARPE⁃19 cells（， n＝9）

表4 低表达VEGFA 对人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖和迁移的影响（， n＝9）Tab.4 Effects of low VEGFA expression on the proliferation and migration of ARPE⁃19 cells（， n＝9）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与高糖＋si⁃con 组比较，＃P＜0.05。

3.6 NF⁃κB 信号通路相关蛋白的表达 与高糖组比较，高糖＋异甘草素组人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中p⁃p65、p⁃IκBα 表达降低（P＜0.05）；与高糖＋异甘草素＋pcDNA⁃con 组比较，高糖＋异甘草素＋pcDNA⁃VEGFA 组人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中p⁃p65、p⁃IκBα 表达升高（P＜0.05），见图5、表6。

4 讨论

图4 Western blot 检测VEGFA、CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表达（Ⅱ）Fig.4 Detection of VEGFA，CyclinD1，MMP2 and MMP9 protein expressions by Western blot（Ⅱ）

表5 高表达VEGFA 可以部分逆转异甘草素处理的人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖和迁移（， n＝9）Tab.5 High VEGFA expression partially reversed proliferation and migration of isoliquiritigenin⁃treated ARPE⁃19 cells（， n＝9）

表5 高表达VEGFA 可以部分逆转异甘草素处理的人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 增殖和迁移（， n＝9）Tab.5 High VEGFA expression partially reversed proliferation and migration of isoliquiritigenin⁃treated ARPE⁃19 cells（， n＝9）

注：与高糖组比较，∗P＜0.05；与高糖＋异甘草素＋pcDNA⁃con 组比较，＃P＜0.05。

图5 Western blot 检测p⁃p65、p⁃IκBα 的蛋白表达Fig.5 Detection of p⁃p65 and p⁃IκBα protein expres⁃sions by Western blot

表6 NF⁃κB 信号通路相关蛋白的表达（， n＝9）Tab.6 Expressions of NF⁃κB signaling pathway⁃associated proteins（， n＝9）

表6 NF⁃κB 信号通路相关蛋白的表达（， n＝9）Tab.6 Expressions of NF⁃κB signaling pathway⁃associated proteins（， n＝9）

注：与高糖组比较，∗P ＜0.05；与高糖＋异甘草素＋pcDNA⁃con组，＃P＜0.05。

DR 的发病机理尚未完全清楚，病变晚期以增殖性糖尿病视网膜病变形成为主，在视网膜增殖性病变的增生膜中有多种细胞参与，其中视网膜色素上皮细胞的增生迁移在增殖性病变中起重要作用，高糖可促进视网膜色素上皮细胞增生［11］。本实验用高糖处理人视网膜上皮细胞系ARPE⁃19，结果显示高糖诱导的人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 存活率显著升高，MMP2、MMP9 蛋白表达显著升高，细胞迁移数量显著升高，说明高糖确实促进了ARPE⁃19 细胞增殖和迁移。有研究发现异甘草素可以抑制肾透明细胞癌786⁃O 细胞的增殖、迁移和侵袭，并通过磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinos⁃itol⁃3⁃kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）／哺乳动物雷帕霉素蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路诱导细胞自噬［12］，异甘草素可通过调控PI3k／Akt 信号通路抑制小儿血管瘤内皮细胞的生长和侵袭，诱导细胞周期阻滞，并促进细胞凋 亡［13］，还可通过下调MMP2 和MMP9 的表达抑制胶质瘤干细胞迁移和侵袭［14］。本实验结果显示，经异甘草素处理的高糖诱导ARPE⁃19 细胞中细胞存活率，MMP2、MMP9蛋白表达和细胞迁移数显著降低，说明异甘草素可以抑制ARPE⁃19 细胞增殖和迁移，预防视网膜病变。

VEGF 高表达可促进血管的异常生长，影响DR 的发生［15］。VEGFA 是VEGF 成员之一，是促血管生成因子，在促进内皮细胞的存活、迁移和增殖以及增强血管通透性中发挥作用，可下调VEGFA 来减轻DR 的发展［16］，同时miR⁃195⁃5p 能通过靶向VEGFA 抑制宫颈癌HeLa 细胞侵袭和转移［17］。本实验结果显示，高糖诱导的人视网膜上皮细胞ARPE⁃19 中VEGFAmRNA 和蛋白表达升高，进一步转染si⁃VEGFA 后发现，ARPE⁃19 细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表达，细胞存活率和细胞迁移数量降低，说明VEGFA 低表达可抑制ARPE⁃19 细胞增殖和迁移；经异甘草素处理后，VEGFAmRNA 和蛋白表达降低，说明该成分可下调VEGFA 表达，从而抑制ARPE⁃19 细胞增殖和迁移。

NF⁃κB 信号通路与糖尿病血管并发症有关，糖尿病视网膜病变患者血清中其表达显著增加［18］，银杏叶提取物可通过抑制NF⁃κB 活性抑制视网膜色素上皮细胞炎症反应，保护视网膜色素上皮细胞，防治糖尿病视网膜病变［19］；柚皮苷能通过抑制炎症，氧化应激和NF⁃κB 活化来减轻糖尿病性视网膜病变［20］。本实验结果显示，异甘草素处理后高糖诱导的ARPE⁃19 细胞中p⁃p65、p⁃IκBα 表达降低，说明该成分可抑制NF⁃κB 信号通路的激活，而过表达VEGFA 逆转了它对高糖诱导p⁃p65、p⁃IκBα 表达的抑制作用，可能通过VEGFA 影响NF⁃κB 信号通路。

综上所述，异甘草素可抑制高糖诱导的ARPE⁃19 细胞增殖和迁移，其机制可能与VEGFA及NF⁃κB 信号通路有关，可为糖尿病视网膜病变的防治提供新方法。