马立威 陈 哲 李 京 由 丹 薛竹宏张洪涛葛鹏玲∗刘吉成∗

（1.黑龙江中医药大学， 黑龙江 哈尔滨150040； 2.齐齐哈尔医学院， 黑龙江 齐齐哈尔161006；3.齐齐哈尔医学院附属第三医院， 黑龙江 齐齐哈尔161099； 4.齐齐哈尔市第一医院， 黑龙江 齐齐哈尔161005）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年增高，已严重危害广大女性的健康［1］。2018 年最新数据显示，全球癌症发病率中乳腺癌发病率以11.6%位居第2 位，同时以6.6% 的死亡率位居癌症死亡率第5 位［2］。临床上以手术治疗、化疗、放疗为主，但放化疗常伴有损伤正常细胞的不良反应，治疗效果并不理想［3⁃4］，故寻找安全有效的治疗药物一直是相关研究热点。近年来，中西医结合治疗乳腺癌成为我国肿瘤研究的前沿和热点，探寻有抗乳腺癌活性的中草药可为相关研究提供物质基础［5］。由于中药较低的毒副作用，从中筛选抗肿瘤活性成分已逐渐成为人们关注的热点领域［6⁃8］，目前植物来源的抗肿瘤药物已超过30%，其中长春新碱、喜树碱、紫杉醇等已成为多种肿瘤化疗的一线药物［9］。目前中医药在乳腺癌治疗中的作用受到广泛关注，复方中药也己经成为相关综合治疗中的一个重要组成部分［10］。传统中药狼毒大戟属大戟科植物，其根长期以来被用于治疗各种疾病，包括水肿、腹水、肝癌、肺癌等疾病［11⁃12］，大戟科植物均性苦寒，善涤脏腑之水邪，为峻下逐水药，有较大的毒性，故临床上组方时常配伍大枣以缓和其峻烈的药性，降低其毒副作用，但减毒作用的机制目前尚不清楚。中药配伍在中医临床用药中也是最常见的形式，具有增疗效、降毒性、调控作用方向等优点。由甘遂、大戟、芫花、大枣组成的仲景名方《十枣汤》 中就应用了大枣的味甘、性湿、补脾和胃、益气生津、滋心润肺、养血安神、悦颜色、通九窍、助十二经而和百药的功效来缓和甘遂、大戟、芫花的峻烈之性及诸药毒性的作用，减少脾胃对毒性药物的反应，使其攻下而不伤正，同时民间也有用狼毒蒸枣后食枣来治疗相关肿瘤。前期对狼毒大戟的抗肿瘤活性的研究多以从中提取的单体化合物为研究对象，而将其作为复方制剂来研究抗肿瘤活性尚未见报道，故本实验以大戟大枣汤含药血清作为实验药物，探讨其抗乳腺肿瘤效果，并初步阐明其作用机制。

1 材料

1.1 细胞株及动物 乳腺癌MCF⁃7 细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，于液氮中保存。SPF 级SD 大鼠，体质量（300±50）g，购自哈尔滨医科大学实验动物医学部，生产许可证号SCXK（黑）2013⁃001，饲养于齐齐哈尔医学院实验动物中心，使用许可证号SYXK（黑）2016⁃001，适应性喂养3 d 后进行实验。实验、饲养及其他处理过程中产生的废弃物及处死的大鼠均统一装入指定袋中，按规定进行处理。实验动物处置符合医学伦理学标准。

1.2 药物 狼毒大戟Euphorbia fischerianaSteud.全株采于黑龙江省泰康县，取其入药部位（根）；大枣Ziziphus jujubaMill.购自药材批发市场（狗头枣，产地陕西绿音，批号20160509⁃1），经齐齐哈尔医学院天然药物化学实验中心郭丽娜教授鉴定为正品。

1.3 试剂 MEM 培养基（美国Gibco 公司，批号1708108）；胎牛血清（美国Hyclone 公司，批号NIJ1221）；双 抗（美 国 Hyclone 公 司，批 号1170005）；BCA 蛋白定量试剂盒（中国北京康为试剂公司，批 号00071407）；抗 体（PI3k、p⁃FoxO3a253、anti⁃MouseIgG H＃＃L、anti⁃Rabbit IgG ＃＃H）（英国Abcam 公司，批号分别为GR277867⁃5、GR324092⁃2、247029⁃14、GR267728⁃13）；p⁃Akt473（美国CST 公司，批号16）；LY2940042（美国CST公司，批号15），固定液、通透液（碧云天生物技术有限公司，编号分别为P0098、P0096）；紫杉醇（中国北京双鹭药业公司，批号20170301）；DAPI（美国Thermo 公司，批号1890343）；ActinGeen488（美国Gene Copoeia 公司，批号1501136T）。

1.4 仪器 R⁃300 型旋转蒸发（瑞士Buchi 公司）；safire2 型酶标仪（奥地利Tecan 公司）；IX51型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；Observer A1型荧光显微镜、LSM710 型激光共聚焦显微镜（德国Zeiss 公司）；Image Xpress Micro 型高内涵细胞成像系统（美国MD 公司）；ChemiDoc MP 型全自动荧光及化学发光系统（美国Bio⁃Rad 公司）。

2 方法

2.1 大戟大枣汤的制备 狼毒大戟与大枣按质量比1 ∶1 混合（狼毒大戟1 kg、大枣1 kg、水10 L），浸泡30 min 后煎煮2 h，待水煎液冷却后重复上述步骤1 次，将水煎液过滤后取滤液，旋转蒸发浓缩至2 L，即得（1 g 生药／mL）。

2.2 含药血清的制备 将SD 大鼠随机分成阴性组（灌胃给予等量生理盐水）及大戟大枣汤高、中、低剂量组（10.0、5.0、2.5 g／kg），每组5只，每日早、晚各灌胃给药1 次，连续3 d。末次给药1 h后，水合氯醛麻醉大鼠，无菌条件下腹主动脉采血，分离血清，贮存于-80 ℃冰箱中，使用前56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm 滤器除菌后使用。

2.3 细胞分组 MCF⁃7 细胞复苏后，用MEM 的完全培养基（含10% FBS，1%青／链霉素混合液）常规培养，2～3 d 传代1 次，剩余细胞于液氮中冻存备用。空白对照组，10%FBS＋90%MEM 培养基；阴性对照组，10% 阴性组血清＋90% MEM 培养基；大戟大枣汤低剂量组，10%大戟大枣汤低剂量组含药血清＋90%MEM 培养基；大戟大枣汤中剂量组，10%大戟大枣汤中剂量组含药血清＋90%MEM 培养基；大戟大枣汤高剂量组，10%大戟大枣汤高剂量组含药血清＋90%MEM 培养基；阳性对照组，10%阴性组血清＋90%MEM 培养基＋8 μg／mL 紫杉醇；阴性对照＋LY294002 组，40 μmol／L LY294002＋10%阴性组血清＋90%MEM 培养基；大戟大枣汤低剂量＋LY294002 组，40 μmol／L LY294002＋10%大戟大枣汤低剂量组含药血清＋90%MEM 培养基；大戟大枣汤中剂量＋LY294002 组，40 μmol／L LY294002＋10%大戟大枣汤中剂量组含药血清＋90%MEM 培养基；大戟大枣汤高剂量组＋LY294002 组，40 μmol／L LY294002＋10% 大戟大枣汤高剂量组含药血清＋90%MEM 培养基。

2.4 Hoechst333342／PI 染色检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2×104／mL，按100 μL／孔接种于96 孔细胞培养板中，待细胞贴壁稳定后按“2.3” 项下分组，每组平行设置6 个孔，待含药血清作用48 h 后终止（含LY294002 的各组需在实验结束前1 h加入）。将预先配好的Ho⁃chest33342 染色液加到各待测孔中，每孔10 μL，37 ℃避光孵育10 min，加入预先用Buffer 液配制好的PI 染色液，每孔5 μL，室温避光孵育10 min。上机检测时按所用孔板型号对应录入仪器，选择激发波长、拍摄通道、拍摄物镜倍数（10×）、拍摄区域，调整聚焦后，进行拍摄，并利用高内涵细胞成像系统分析软件对细胞荧光强度进行分析。

2.5 吖啶橙⁃溴乙锭染色观察细胞形态 取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1.0×105／mL，均匀铺到6 孔细胞培养板中，待细胞贴壁稳定后，分组、加药。实验分为空白对照组，阴性对照组，大戟大枣汤低、中、高剂量组，阳性对照组，加入含药血清，放入细胞培养箱中继续孵育48 h 后终止作用。将吖啶橙、溴乙锭按照1 ∶1 的比例混合后，用试剂盒自带Buffer 稀释10 倍，涡旋混匀，加到6孔板中，每孔200 μL，室温避光孵育5 min 后，荧光显微镜下观察并拍照。

2.6 免疫荧光法检测蛋白的表达 完全培养基调整生长状态良好的细胞浓度为1.0×105／mL，每孔200 μL，均匀加入共聚焦显微镜专用的48 孔细胞培养板（黑壁底透），放入细胞培养箱待细胞贴壁稳定后进行实验。分为阴性对照组，大戟大枣汤低、中、高剂量组，阳性对照组，含药血清作用48 h 后终止作用。将48 孔板经固定液固定、通透液通透后，用1% BSA 的PBS 在37 ℃下封闭30 min，加入一 抗（p⁃FoxO3a、p⁃Akt、PI3k），4 ℃冰箱中孵育过夜，二抗对应加入细胞板各孔内，室温避光孵育60 min，并按照试剂说明书（DAPI、ActinGeen488）对细胞核及细胞骨架进行染色，激光共聚焦显微镜下观察并记录接受不同处理的MCF⁃7 细胞的形态变化及荧光强度并拍照，拍照时将激光强度调成一致。

2.7 Western blot 检测蛋白表达 取生长状态良好的MCF⁃7 细胞，调整细胞浓度为2.0×105／mL，每个培养皿（100 mm）加8.0 mL 完全培养基，放入培养箱中，待细胞贴壁稳定后进行实验。分为阴性对照组、阴性对照组＋LY294002、大戟大枣汤中剂量组、大戟大枣汤中剂量组＋LY294002，加入含药血清的培养基作用48 h后终止（含LY294002 的各组在细胞培养结束前1 h 加入），每个培养皿里加1.0 mL 含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，提取细胞总蛋白后按照BCA 试剂盒说明书操作，计算各样品的蛋白浓度。蛋白经100 ℃水浴变性后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分离，然后经过转膜、封闭、一抗（GAPDH、p⁃FoxO3a、p⁃Akt）反应、二抗反应后进行曝光、获取图片。

2.8 统计学分析 应用SPSS 17.0 软件进行处理，数据以（）表示，根据方差齐性检验结果，组间比较应用Dunnet⁃t法，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大戟大枣汤含药血清联合LY294002 对MCF⁃7 细胞凋亡的影响 空白对照组、阴性对照组中细胞几乎没有凋亡，Hoechst333342 染色的蓝色荧光强度较弱，同时由于PI 不能透过细胞膜完整的细胞，故红色荧光强度也很弱，但可见细胞饱满，呈清晰完整的圆形或椭圆形。对于大戟大枣汤低、中、高剂量组及阳性对照组，细胞均可见蓝色荧光，且随着含药血清剂量的增加，蓝色亮染的细胞数目明显增多，同时被PI 染色的细胞数量也增多，红色荧光强度也逐渐增强，个别组细胞可见核碎裂、核解体等现象；对于与LY294002 联合作用的各组（阴性对照＋LY294002 组、大戟大枣汤低剂量＋LY294002 组、大戟大枣汤中剂量＋LY294002组、大戟大枣汤高剂量＋LY294002 组）细胞，LY294002 作用浓度不变，也随着含药血清剂量的增加，细胞形态及荧光强度变化情况同单独给予含药血清的各组细胞变化趋势相似，但变化程度明显增加，见图1。经高内涵分析可知，与阴性对照组比较，随着含药血清剂量的增加各组细胞荧光强度值逐渐增 强（P＜0.05，P＜0.01）；对于与LY294002 联合作用的各组细胞，在LY294002 作用浓度不变的情况下细胞荧光强度值与阴性对照＋LY294002 组比较，也随着含药血清剂量的增加而增强（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

图1 Hoechst333342／PI 染色观察各组细胞凋亡的形态学Fig.1 The observation of cell apoptosis morphology in each group by Hoechst333342／PI staining

表1 大戟大枣汤含药血清联合LY294002 对MCF⁃7 细胞凋亡的影响（， n＝6）Tab.1 Effects of DEFSJ medicated serum combined with LY294002 on MCF⁃7 cells apoptosis（， n＝6）

表1 大戟大枣汤含药血清联合LY294002 对MCF⁃7 细胞凋亡的影响（， n＝6）Tab.1 Effects of DEFSJ medicated serum combined with LY294002 on MCF⁃7 cells apoptosis（， n＝6）

注：与阴性对照组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与阴性对照＋LY294002 组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 大戟大枣汤含药血清对MCF⁃7 细胞形态的影响 空白对照组、阴性对照组细胞呈均匀绿色荧光；大戟大枣汤低、中、高剂量组随着含药血清剂量的增加，红色荧光逐渐增强，合并后的图形可见橘红色荧光增加，同时随着含药血清剂量的增加细胞密度也出现了减少；阳性对照组细胞贴壁能力下降，形态变得圆润，细胞数量减少，红色荧光较强，合并后也呈较明显的橘红色荧光。见图2。

图2 吖啶橙⁃溴乙锭染色观察各组细胞形态学变化Fig.2 Observation of the cellular morphological changes of each group by acridine orange⁃ethidium bromide staining

3.3 大戟大枣汤含药血清对MCF⁃7 细胞PI3k／Akt信号通路的影响 如图3～6 所示，与阴性对照组比较，大戟大枣汤低、中、高剂量组及阳性对照组MCF⁃7 细胞中PI3k、p⁃Akt、p⁃FoxO3a 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），随着含药血清剂量的增加逐渐降低。免疫荧光检测时加入了DAPI、Action 探针染色，可见明显的细胞形态轮廓，大戟大枣汤低、中、高剂量组随着大戟大枣汤含药血清剂量的增加，被DAPI 染色的细胞亮度均逐渐增强，细胞形态也出现了皱缩，细胞密度有所降低，并出现少量细胞碎片等典型的细胞凋亡的形态特征。

图3 免疫荧光法检测各组MCF⁃7 细胞PI3k 蛋白表达Fig.3 Detection of PI3k protein expression in MCF⁃7 cells of each group by immunofluorescence

图4 免疫荧光法检测各组MCF⁃7 细胞p⁃Akt 蛋白表达Fig.4 Detection of p⁃Akt protein expression in MCF⁃7 cells of each group by immunofluorescence

图5 免疫荧光法检测各组MCF⁃7 细胞p⁃FoxO3a 蛋白表达Fig.5 Detection of p⁃FoxO3a protein expression in MCF⁃7 cells of each group by immunofluorescence

3.4 大戟大枣汤含药血清联合LY294002 对PI3k／Akt 信号通路相关蛋白表达的影响 如图7 所示，LY294002 加入前，单独大戟大枣汤中剂量组作用的MCF⁃7 细胞与单独阴性对照组比较，细胞p⁃Akt、p⁃FoxO3a 蛋白表达均降低；LY294002 加入后，阴性对照组＋LY294002 组与阴性对照组比较，细胞p⁃Akt、p⁃FoxO3a 蛋白表达降低；大戟大枣汤中剂量组＋LY294002 与大戟大枣汤中剂量组比较，细胞p⁃Akt、p⁃FoxO3a 蛋白表达也有所降低。

图6 大戟大枣汤含药血清对MCF⁃7 细胞PI3k、p⁃Akt、p⁃FoxO3a 蛋白表达的影响Fig.6 Effects of DEFSJ medicated serum on protein expression of PI3k，p⁃Akt，and p⁃FoxO3a in MCF⁃7 cells

图7 大戟大枣汤含药血清联合LY294002 对p⁃Akt、p⁃FoxO3a蛋白表达的影响Fig.7 Effects of DEFSJ medicated serum combined with LY294002 on protein expression of p⁃Akt and p⁃FoxO3a in MCF⁃7 cells

4 讨论

诱导肿瘤细胞凋亡已经成为抗肿瘤药物研究的主流方向，无论是传统细胞毒药物或是靶向治疗药均通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥作用，因此诱导细胞凋亡是评价抗肿瘤药物疗效的主要指标［13］。乳腺癌发生发展是一个多阶段、多步骤的复杂过程，其发病作用机制并不完全清晰，细胞增殖与凋亡的失衡是其关键性因素，故抑制细胞过度增殖及诱导细胞凋亡在相关治疗中具有重要意义［4］。本研究通过高内涵细胞成像系统定性及定量的分析，考察了Hochest33342／PI 染色后大戟大枣汤含药血清对细胞凋亡的影响，结果大戟大枣汤含药血清可以诱导MCF⁃7 细胞凋亡。通过AO／EB 染色进一步发现，随着含药血清剂量的增加，细胞形态变化明显，细胞数量逐渐减少，代表凋亡增多的红色荧光强度逐渐增强，因此，初步证实大戟大枣汤含药血清可诱导MCF⁃7 细胞发生凋亡。细胞凋亡是受基因调控的一种程序性死亡，受到一系列的信号传导途径调控，其中作为细胞内重要信号转导通路之一的PI3k／Akt 信号通路，不仅对正常细胞的生长、存活、增殖及凋亡有调控作用，对肿瘤的发生、发展也产生重要的影响［14］。也有研究指出，乳腺癌中PI3k／Akt 信号通 路的活 化高达70%［15］，而FoxO3a 是PI3k／Akt 信号通路下游一个重要的因子，同时PI3k／Akt 信号通路也是调节FoxO3a 的最主要途径，是肿瘤凋亡、周期调控的关键因子之一。活化FoxO3a 可上调细胞凋亡因子，同时调节细胞周期因子，从而促进细胞凋亡和周期阻滞，抑制肿瘤的发生和发展［16］。本研究通过高内涵细胞成像系统结合Hochest33342／PI 染色分析了大戟大枣汤含药血清对细胞凋亡的影响时，添加了PI3k特性抑制剂LY294002，发现加入LY294002 比同剂量单独含药血清组对细胞的凋亡作用明显增强。同时，本研究采用了荧光染色标记的方法，通过激光共聚焦显微镜检测PI3k／Akt 信号通路相关蛋白表达的变化，显示大戟大枣汤含药血清作用MCF⁃7细胞PI3k、p⁃Akt、p⁃FoxO3a 蛋白的荧光强度随着含药血清剂量增加逐渐降低，即蛋白表达量逐渐降低。最后，又通过Western blot 检测LY294002 加入后对PI3k／Akt 信号通路相关蛋白表达的影响，发现对比同剂 量单独 含药血清组，p⁃Akt、p⁃FoxO3a 蛋白表达均有所降低，表明PI3k／Akt 信号通路参与了大戟大枣汤含药血清诱导MCF⁃7 细胞凋亡作用调控。