方芝，陈勇儿，贺莲，黄松，侯少贞

( 1．广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东 广州 510006； 2．广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006； 3.广东食品药品职业学院，广东 广州 510520)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis， UC) 主要以腹痛腹泻、便血黏血为临床表现。该病多绵延不愈反复发作，呈慢性病程，其已经被世界卫生组织认定为世界难治性疾病之一[1]。由于UC的发病机制并未被研究清楚，探讨日常饮食因素对UC病情的影响十分必要。木糖醇是一种从植物(甘蔗、玉米渣等)中提取出的常用天然甜味剂[2-3]，广泛被添加于各种饮料和食品中。有报道指出进食一定量的木糖醇，可引起腹泻，这可能与其影响肠道渗透压有关[4]。腹泻发病原因和具体机制复杂多样，其中在肠道刷状缘上的钠氢交换体(Na/H exchangers,NHEs)功能与肠道腹泻存在密切的关系[5-6]。动物肠刷状缘膜上的NHEs 包括NHE1、NHE2和NHE3三种类型的蛋白，NHE1位于远端结肠上，其与碳酸氢根的运输密不可分；而NHE2、NHE3在结肠和小肠中均有发现[7-9]。Moeser等[10-11]研究表明若将老鼠敲除NHE3后，动物出现腹泻，这证明了NHE3在钠离子跨膜转运的时候发挥了重要的作用，其缺失可能是引起腹泻的直接原因。SGLT-1 是主动转运蛋白，负责在食物中吸收葡萄糖及半乳糖，主要在小肠黏膜的刷状缘表达。SGLT-1与NHE3均参与了肠道正常运输Na+和葡萄糖等过程，并且SGLT-1/NHE3通路表达异常与溃疡性结肠炎的发病密切相关[12-13]。木糖醇引起的腹泻是否会加重结肠炎的病变及SGLT-1/NHE3通路表达的异常，目前均未见研究报道。本研究拟通过硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导建立UC模型，并给UC小鼠自由饮用不同浓度的木糖醇饮料，考察木糖醇饮料对UC小鼠结肠病变的影响及对SGLT-1/NHE3通路表达的改变。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

木糖醇(xylitol)由阿法埃莎(中国)化学有限公司制备提供，批号：A18944；普通标准小鼠饲料购买于广州中医药大学实验动物中心；生理盐水，购于山东华鲁制药有限公司，批号：B16020402；PMSF和商品化的蛋白酶抑制剂(批号：AB432322)、PBS(批号：AB217272)，均购于赛默飞世尔生物化学有限公司；4%(φ)多聚甲醛，购于广州化学试剂厂，批号：20180302-2；硫酸葡聚糖钠(DSS)，购于西宝生物科技(上海)股份有限公司，批号：1840050；异硫氰酸荧光素-硫酸葡聚糖(FITC-dextran)，购于美国Sigma公司，批号：#BCBV6326；4%多聚甲醛固定液，购于Biosharp生物公司，批号：1611976；苏木素伊红染液，购于北京吉美生物技术有限公司，批号：JD3207；无水乙醇，购于广州化学试剂公司，批号：20180703-2；乙醚，购于西陇化工股份有限公司，批号：180107；组织包埋盒，由江苏世泰实验器材有限公司提供，批号：19022。

1.2 仪器与设备

移液枪(量程分别为5 mL，100～1 000 μL，1～100 μL，1～20 μL)，德国Eppendorf公司，型号：3120 000.224；普通电子天平，型号：G&GJJ2000，江苏常熟市双杰测试仪器厂；万分之一分析天平，型号：BS110S，德国Sartorius公司；-80 ℃超低温冰箱(柜)，海尔公司；4 ℃离心机，湘仪离心机仪器有限公司，型号：TGL20MW；光学显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司，型号：CKC2000；超纯水仪，广州誉维生物科技仪器有限公司，型号：K9860；组织脱水仪、组织包埋机和组织切片机均购于美国Thermo Fisher Scientific生物公司，型号分别为YD-6LA、TEC2800、KD-2508；激光共聚焦显微镜，型号：Smartproof 5，德国卡尔蔡司公司。

1.3 实验动物

45只 SPF级雄性KM小鼠，体质量25～30 g，广州中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

1.4 方法

1.4.1 UC模型的建立[14]采用2.5%DSS诱导小鼠出现UC。另将适量的木糖醇溶于2.5%的DSS溶液中，分别配制成质量浓度为0.1、0.05、0.025 g/mL的木糖醇饮料供试验。

将昆明雄性小鼠随机分为5组，即正常组(Normal)、UC 模型组及木糖醇饮料高、中、低剂量组。正常组给予蒸馏水；模型组给予2.5%DSS溶液；木糖醇高、中、低各组分别给予上述木糖醇饮料(浓度分别为10%、5%、2.5%)。各组小鼠均自由饮用和进食，连续14 d。以正常小鼠作为对照，UC模型组小鼠出现体质量显著减轻、稀便甚至血便视为小鼠出现UC；观察各组小鼠体质量和粪便的变化情况。

1.4.2 药效评价指标 分别于造模、干预期间，每天记录动物的体质量和饮食饮水情况，观察动物的基本状态，主要包含精神状态、毛发、稀便血便的程度并评分疾病活动指数[15]。0：体质量无下降，粪便性状正常，隐血；1：体质量下降1%～5%，粪便较软，出现较模糊的红色，不易分辨；2：体质量下降5%～10%，粪便湿软十分明显，出现能分辨较模糊的红色；3：体质量下降10%～20%，半稀便，粪便出现明显的红色；4：体质量下降>20%，便稀，粪便较深和大范围的红色，红色面积比3分大。

解剖后记录结肠长度、厚度、溃烂及粘连情况，计算结肠宏观评分。结肠组织宏观评分根据Ruiz[16]之前所制定的评判手段。0：正常；1：局部水肿，无溃疡和组织坏死；2：两处组织溃疡坏死，溃疡长度>1 cm；3：组织溃疡坏死多处，溃疡长度>2 cm。

1.4.3 肠道通透性检测[17]末次木糖醇干预后禁食12 h，以1 mg/mL 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖灌胃(0.1 mL /10 g)，4 h后，动物采用乙醚麻醉后用毛细玻璃管眼眶取血，离心15 min。精确吸取100 μL血清，在避光状态下添加到黑色荧光酶标板上，每孔加入标准品100 μL，在波长480 nm和520 nm处检测样品的荧光强度。

1.4.4 结肠组织病理学分析 参考文献[18]，按照常规方法制作结肠组织切片及设置病理评分标准。在尼康倒置显微镜下观察各组结肠的病变情况。

1.4.5 免疫组化方法检测紧密连接蛋白的表达[19]取结肠组织在-20 ℃区域用OTC包埋成型后，切片固定在玻片上，用 PBS 漂洗后在封闭缓冲液中封闭标本 60 min。按照说明书中推荐的稀释比例(1∶200)，在抗体稀释缓冲液中配制一抗(分别为ZO-1抗体和Occludin抗体)。甩干封闭缓冲液，加入稀释后的一抗，在4 ℃下孵育过夜。用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗(驴抗兔抗体)稀释后，室温下避光孵育标本 1～2 h。避光状态下使用 DAPI (#8961) 染色5 min，封片后在激光共聚焦显微镜下观察蛋白的表达情况。

1.4.6 Western blot法检测SGLT-1和NHE3的表达

1.4.6.1 小鼠结肠组织匀浆 截取小鼠结肠段，称取120 mg，加入800 μL的已混合1 mmol/L PMSF的RIPA强裂解液，研磨均匀后将离心管从组织研磨机中取出，放入离心机中，以4 ℃、12 000 r/min的条件离心20 min；吸取上清液置于干净预冷的离心管中-20 ℃保存。

1.4.6.2 小鼠结肠组织BCA浓度测定 按BCA试剂盒说明书完成蛋白标准品的制备、BCA工作液的制备、加样测定吸光度；根据标准曲线计算样品的蛋白浓度，将各个样品调整为相同蛋白浓度；将定量后的样品蛋白与5×上样缓冲液按照4∶1(v∶v)的比例混匀，用电磁炉煮沸5 min，冷却后分装，-20 ℃保存。

1.4.6.3 配胶、上样、电泳 按Weng等方法[20]先配好分离胶，用无水乙醇压胶后按上表比例配好浓缩胶，待胶完全凝固后开始上样，将两侧加入Marker以便标记分子量位置。组织样品上样体积为10 μL，Marker的上样体积为5 μL。在电压80 V，电泳时间40 min条件下跑浓缩胶；分离胶的跑胶条件则为电压120 V，电泳时间60 min；跑至目的蛋白相通分子量Marker条带分离即可。倒入转膜缓冲液，300 mA恒流转膜1 h；将转膜后的PVDF膜根据Marker分子量切出条带区域，做好标记，随后用TBST清洗3次，每次10 min；把条带浸入5%BSA配置的封闭液中，置于室温，摇床上振荡2 h。

1.4.6.4 孵抗体 分别把条带浸入各目的蛋白所在的抗体稀释溶液中，NHE3、SGLT-1和β-actin均各用抗体稀释液稀释为1∶1 000，置于4 ℃冰箱孵育过夜。把条带浸入TBST配制的二抗(用抗体稀释液稀释为1∶2 000)，置于摇床上室温孵育3 h；随后用冰TBST清洗3次，每次10 min。

1.4.6.5 显影 将ECL化学发光液按试剂A∶试剂B=1∶1的比例避光配制适量，混匀后均匀滴加在PVDF膜正面，在显影仪中进行显影检测。

1.4.6.6 数据处理 使用Image J分析软件处理图片中各个条带的灰度值，并进行对比分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠外观表征的变化

正常组小鼠精神状态良好，毛发整洁，粪便成型并且颜色正常，状态较为活跃；模型组自由饮用2.5%的DSS溶液后，逐渐出现稀便，毛色蓬乱潮湿，进食量减少，个别动物出现便血。同时饮用木糖醇与DSS的混合溶液后，随着木糖醇浓度的升高，动物的饮食量下降明显，出现血便的情况更加明显，提示高浓度木糖醇可加重UC小鼠的病变。

图1 木糖醇干预UC小鼠Figure 1 Effect of xylitol on signs of UC mice

2.2 木糖醇对UC模型小鼠疾病活动指数的影响

按 “1.4.2”计算小鼠疾病活动指数(DAI)，以直观地反映小鼠的病程变化。由图2可知，与正常组比较，模型组小鼠DAI显著上升(P<0.01)；与模型组相比，高浓度组木糖醇饮料组DAI明显升高(P<0.01)。表明高浓度木糖醇饮料能够加剧溃疡性结肠炎小鼠的病变。

Normal2.5%DSS2.5%DSS+2.5%xylitol2.5%DSS+5%xylitol2.5%DSS+10%xylitol2.82.11.40.70.0活动指数036912**##t/d

2.3 木糖醇对UC小鼠肠道通透性、结肠组织长度及厚度的影响

图3结果显示：与正常组相比，模型组小鼠的结肠组织长度未明显缩短(P>0.05)，但结肠组织显著增厚(P<0.01)；与模型组比较，高剂量木糖醇饮料组结肠组织长度明显缩短，结肠组织厚度增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。与正常组比较，模型组小鼠与低浓度木糖醇饮料组小鼠肠道通透性变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，中、高浓度组木糖醇饮料组小鼠的肠道通透性明显升高，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结肠宏观病理改变评分结果可知，肉眼观察即可发现中、高浓度组木糖醇饮料组小鼠结肠的病变明显(P<0.01或P<0.05)。

2.4 各组小鼠组织病理观察结果

结肠组织HE结果显示，正常组小鼠结肠组织中无明显的炎性细胞浸润，细胞之间紧密连接，杯状细胞和隐窝均无坏死或缺失，结肠组织结构清晰完整，杯状细胞和隐窝结构完整，排列整齐；与正常组小鼠相比，模型组小鼠结肠黏膜层组织出现多处的组织溃烂以及坏死，细胞与细胞间的排列紊乱不紧密，部分杯状细胞缺失；木糖醇干预组结肠组织的细胞形态发生较为明显的变化，大量的炎性细胞浸润结肠组织，杯状细胞明显肿大，出现较为明显的缺失，炎性细胞聚集。随着木糖醇饮料浓度的升高，结肠组织病理学评分明显增高，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

2.5 木糖醇对UC小鼠组织紧密连接蛋白表达的影响

由图5可知，正常组的ZO-1和Occludin的表达较为紧密，结构清晰；模型组小鼠能够降低紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达、结构模糊；而随木糖醇浓度的增高，UC小鼠结肠ZO-1和Occludin的表达进一步下降，其中木糖醇中、高剂量组与模型组的表达差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。表明木糖醇能够加剧UC小鼠的结肠黏膜屏损伤。

A.结肠组织HE染色(200×)； B.动物结肠组织病理评分。与正常组比较：##P<0.01； 与模型组比较：**P<0.01。

A.紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光图； B.紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光强度统计； C.紧密连接蛋白Occludiin免疫荧光图； D.紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光强度统计。

2.6 木糖醇对UC小鼠组织肠刷状缘钠-氢转运蛋白SGLT-1和NHE3表达的影响

由图6可知，正常组比较，模型组小鼠结肠NHE3和SGLT-1的表达显著下降(P<0.01)。与模型组比较，木糖醇干预组随木糖醇浓度增高，NHE3和SGLT-1的表达进一步降低，差异有统计学意义(P<0.01)。这表明木糖醇可通过抑制钠/葡萄糖共转运蛋白1(SGLT-1)从而减少NHE3的易位并引起肠刷缘破坏，加剧小鼠溃疡性病变。

Normal2.5%DSS2.55.0102.5%DSS+xylitol(%)Normal2.5%DSS2.55.0102.5%DSS+xylitol(%)1.61.20.80.40.01.61.20.80.40.0####**##*######**##*##结肠NHE3的相对表达结肠SGLT-1的相对表达

3 讨论

木糖醇是一种常用的、安全性比较高的天然甜味剂，广泛用于食品和饮料的添加[21]。迄今，关于木糖醇对人体的不良影响的报道极少，已知的不良反应主要为腹泻。腹泻是结肠炎患者一个典型的症状，本实验的研究目的旨在探讨木糖醇摄入后是否会加剧结肠炎的病变。

木糖醇的甜度与蔗糖接近，市售含糖饮料的浓度一般为5%～10%，因此实验中木糖醇设置的浓度最高为10%。实验结果发现10%的木糖醇饮料可加剧DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎引起的腹泻，甚至个别动物血便情况加重。木糖醇可进一步降低UC小鼠肠壁屏障的功能，表现为肠上皮紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达的显著下降；同时，与腹泻发生密切相关的SGLT-1/NHE3通路的表达亦显著下调。这提示高浓度木糖醇饮料对UC小鼠存在不利的影响，能加重其结肠病变程度。

让研究人员不解的是，10%的木糖醇溶液可明显加剧UC小鼠结肠病变，这与木糖醇在人群广泛应用但不良反应报道极少相悖。推测其原因可能与不同种属对木糖醇的敏感性不同，例如大剂量的木糖醇对狗、猫有明显的副作用[22]；另外人体对木糖醇的耐受性比较高，少量摄入未能诱发不良反应。尽管如此，基于临床UC患者的发病机制复杂、病情容易复发，笔者建议UC患者尽量避免摄入含量高的木糖醇饮料或食物，以减少潜在的风险。另外，本课题组后续实验也发现：木糖醇饮料对结肠产生的不良影响是可逆的，只要停止木糖醇的摄入，小鼠出现的肠道不良反应即可快速消除。因此，科学使用木糖醇，即能避免其对机体潜在的不良影响。