刘清娥，于晓凡，杨家玥，陈 强

脑出血是发病急、病势凶、预后差的一类急性脑血管疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、高经济负担的“五高”特点，严重危害人类健康和生命安全。脑水肿是脑出血急性期最关键的病理过程，决定了脑出血疾病的转归和预后，减轻脑水肿是治疗急性脑出血的关键[1-2]。目前，甘露醇、甘油果糖、呋塞米、激素等药物治疗脑水肿得到公认，但存在水电解质代谢紊乱、肾功能损害、血压骤降等副作用。田黄颗粒是近几年研究的具有脑出血后脑保护作用的中药颗粒剂，在脑出血治疗中发挥出一定优势，前期研究观察到田黄颗粒可有效抑制脑出血大鼠炎性细胞因子表达，降低脑出血病人基质金属蛋白酶-9的表达，减轻脑损伤后炎症级联反应及脑水肿、脑血肿体积，改善神经功能，起到脑保护作用[2-4]。本研究旨在前期研究基础上，通过动物实验探究田黄颗粒干预脑出血、减轻脑水肿效应及对水通道蛋白-4 mRNA(AQP-4 mRNA)的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体质量250～300 g，清洁级，购自维通利华公司(动物合格证号：11400700133176)。

1.1.2 实验用药 田黄颗粒(三七、大黄、冰片)、20%甘露醇。三七颗粒(华润三九医药股份有限公司生产，批号：1510001s)、大黄颗粒(华润三九医药股份有限公司生产，批号：1603001s)、冰片(江阴天江药业有限公司生产，批号：1511004)3种药物比例为10∶40∶1。20%甘露醇(百特医疗有限公司，批号H20073135)。

1.1.3 RT-PCR试剂盒 由大连宝生物工程有限公司提供，引物由上海生工工程有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及纳入与排除标准 按照Rosenberg等报道的[5]方法复制大鼠脑出血模型。参照Zea-Longa评分法[6]，分为5级(0～4分)，于大鼠清醒后进行评分。评分在2～3分的大鼠用于本实验。2分以下及3分以上剔除。

1.2.2 动物分组 选用造模成功的SD大鼠，随机分为4组：模型组；中药组，每日按6 g/(kg·d) 剂量给予田黄颗粒灌胃；西药组，经大鼠尾静脉用输液泵持续泵入20%甘露醇10 mg/kg，60 min内滴完，每8 h给药1次；中西药组，给药方法为中药组及西药组给药方法的联合用药。田黄颗粒给药剂量换算参考《药理实验方法学》[7]。各组大鼠分别于术后第1天、第3天、第7天观察各项指标。

1.2.3 观察指标 ①脑组织含水量测定：干-湿重法测定脑组织含水量，大鼠断头处死取脑，沿脑桥上界水平切断，弃去小脑及双侧嗅球，将剩余脑组织沿中线切开，滤纸吸干表面水分，分别称取左右两侧脑组织湿重，恒温烤箱110 ℃烘干至恒重后称取干重，计算各组模型大鼠左右两侧脑组织的含水量，脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重。②脑组织AQP-4 mRNA的测定：分别取各组大鼠出血脑组织右半部分进行RT-PCR实验。按照RT-PCR两步法试剂盒操作说明操作。③行为学评分：Zea-Longa评分法，0分为无神经系统损害症状；1分为不能完全伸直左前爪；2分为向左侧转圈；3分为行走时向左侧倾斜；4分为不能自发行走，意识丧失。

2 结 果

2.1 大鼠脑组织含水量测定结果 模型组大鼠术后第1天出现轻度脑水肿现象；第3天脑水含量明显增加；第7天脑含水量较前下降。第1天时各治疗组大鼠脑含水量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；第3天、第7天时各治疗组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，中西药组脑含水量低于中药组和西药组(P<0.01)，西药组低于中药组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠脑含水量比较 (±s) 单位：%

2.2 各组大鼠AQP-4 mRNA的测定结果 模型组大鼠术后第1天脑组织AQP-4 mRNA开始增高，第3天AQP-4 mRNA增高，第7天时AQP-4mRNA较前下降。第1天、第3天、第7天各治疗组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，中西药组AQP-4 mRNA较中药组、西药组下降明显(P<0.05或P<0.01)，西药组在第3天、第7天时AQP-4 mRNA下降优于中药组(P<0.05)。详见表2。

表2 不同时间点各组大鼠AQP-4mRNA光密度积分比值比较 (±s)

2.3 各组大鼠Zea-Longa评分结果 第1天时各治疗组大鼠Zea-Longa评分与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；第3天和第7天，各治疗组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，中西药组大鼠评分优于中药组和西药组(P<0.05或P<0.01)，西药组优于中药组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 不同时间点各组大鼠Zea-Longa评分比较 (±s) 单位：分

3 讨 论

脑出血属于中医学出血性中风范畴，病变部位在脑，病机复杂，多为本虚邪实、痰瘀交结，上犯冲脑而发病。急性期以邪实为主，注重祛瘀活血、涤痰通络、开窍醒神。田黄颗粒主要成分是三七、大黄和冰片。君药三七功善止血活血，具有化瘀止血、消肿止痛等功效，三七总皂甙是其主要药理活性成分，具有改善心脑微循环、保护神经细胞等作用[8]。大黄具有凉血祛瘀通经之功效，具有抗凝和促凝双向调节作用，在减轻脑出血病人的神经功能损害、减轻脑水肿等方面有一定疗效[9-10]。臣药冰片芳香走窜，能够开窍醒脑祛痰、引药上行，药理研究发现冰片能有效促进其他药物透过血脑屏障而发挥最大作用，越来越多应用于脑靶向给药策略中[11]。同时有研究发现，冰片能改善中风后神经血管单元功能，具有脑保护作用[12]。且本实验中大鼠灌胃冰片含量在口服冰片毒性安全范围内[13]。

本研究发现，脑出血大鼠术后第1天出现轻度脑水肿现象，第3天时脑含水量明显增加，第7天时脑含水量较前下降。脑出血第3天和第7天时，中药组可以明显降低大鼠脑含水量，中西药组与中药组、西药组比较，降低脑含水量作用更加明显。说明田黄颗粒能有效减轻脑出血急性期脑水肿，且在水肿高峰期效果显著。刘青等[14]利用大黄干预脑出血大鼠模型，发现大黄能够减低脑出血大鼠模型脑组织含水量，减轻水肿，发挥保护神经功能的作用。给予早期脑出血病人三七总皂甙注射液，可减轻脑血肿，缓解脑水肿[15]。

水通道蛋白是一种细胞膜通道蛋白，在水分子的跨膜流动方面起着关键作用，分布于中枢神经系统的水通道蛋白有数种，以AQP-4分布最广，主要分布于脑室系统的室管膜、蛛网膜下腔及血管周围的星形胶质细胞以及渗透压感受区，参与脑水稳态的调节，在脑血管病脑水肿形成和控制过程中起重要作用[16]。干预AQP-4的表达可以作为减轻脑水肿的治疗靶点[17]。通过下调AQP-4的表达，可改善脑外伤大鼠的脑水肿[18]。抑制AQP-4的活性，降低脑含水量，减轻脑水肿继发的颅脑损伤[16]。研究发现，抑制AQP-4的表达不仅能抑制脑水肿，还可减少凋亡基因Caspase-3和增加抑制凋亡基因Bcl-2的表达，减轻脑出血大鼠神经元凋亡[19]。本实验结果提示，与模型组相比在治疗的第1天、第3天、第7天，中药组大鼠脑组织AQP-4 mRNA下降，而中西药组AQP-4 mRNA下降优于西药组和中药组，这与本研究在田黄颗粒缓解大鼠脑水肿的结果一致。蒙兰青等[20]研究发现，三七总皂甙治疗组脑出血大鼠各时间点AQP-4的蛋白、mRNA均在低水平表达，脑含水量降低，减轻了脑水肿形成。彭绍鹏等[21]发现大黄素治疗后脑出血大鼠脑组织含水量、脑组织中AQP-4含量均降低，提示大黄素能够下调AQP-4的表达，减轻脑水肿，促进神经功能的修复。

本研究通过对大鼠行为学评分的观察，发现联合田黄颗粒治疗后脑出血大鼠行为学评分改善效果显著，与本课题组前期研究结果一致。田黄颗粒能够减轻急性脑出血后脑水肿，对西药有一定的协同作用，其改善水肿疗效机制可能与降低AQP-4 mRNA有关。当然AQP-4并不是改善脑水肿的唯一因素，田黄颗粒也具有多途径、多靶点的药理作用，仍需进一步地深入研究。