徐娅玲 冯晋 杨琼英 周晓楠 何芳雁

摘要：目的 通过比较天麻活性成分对羟基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde，4-HBd）对脑缺血再灌注损伤模型大鼠皮层区氨基酸类神经递质的影响，探讨4-HBd抗神经细胞凋亡的可能机制。方法 采用线栓复制大鼠大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型，于脑缺血2h再灌注2h给予受试物，用微透析脑探针动态采集各组大鼠不同时间点皮层区脑透析液，以HPLC-FLD法检测谷氨酸（Glu）、天门冬氨酸（Asp）、γ-氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）的含量并进行比较。结果 与MCAO/R模型组比较，4-HBd能降低模型大鼠脑透析液中0.25h-6h、10h-24h Glu水平（P<0.05，P<0.01），但Asp、GABA和Gly水平无明显变化。结论 4-HBd对抗神经细胞凋亡的作用可能与通过降低EAA类神经递质Glu水平有关。

关键词：脑缺血再灌注损伤;对羟基苯甲醛;氨基酸类神经递质

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）09-0061-06

Effect of P-hydroxybenzaldehyde on Amino Acid Neurotransmitters in the Cortexof Rats with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

XU Ya-ling，FENG Jin，YANG Qiong-ying，ZHOU Xiao-nan，HE Fang-yan

（Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China）

【Abstract】Objective： To compare the effect of 4-hydroxybenzaldehyde（4-HBd），an active ingredient of Gastrodia elata，on amino acid neurotransmitters in the cortex of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury and to explore the possible mechanism of death of 4-HBd on neuronal apoptosis. Methods： The middle cerebral artery occlusion/reperfusion（MCAO/R）model rats was replicated with suture. The test substance was administered after 2 hours of cerebral ischemia and 2 hours of reperfusion. The rats of each group were dynamically collected at different time points with a microdialysis brain probe. HPLC-FLD was used to detect and compare the contents of glutamic acid（Glu），aspartic acid（Asp），γ-aminobutyric acid（GABA）and glycine（Gly）. Results： Compared with the MCAO/R model group，4-HBd can reduce the 0.25h-6h，10h-24h Glu levels in the brain dialysis fluid of model rats（P<0.05，P<0.01），but Asp，GABA and Gly levels had no significant changes. Conclusion： The effect of 4-HBd on neuronal apoptosis may be related to reducing the level of EAA neurotransmitter Glu.

【Key words】cerebral ischemia-reperfusion injury，p-hydroxybenzaldehyde，amino acid neurotransmitters

中枢神经系统内的兴奋性氨基酸（Excitatory amino acids，EAA）和抑制性氨基酸（Inhibitory amino acids，IAA）在脑内维持兴奋-抑制平衡，对认知、运动等功能具有重要的调节作用[1]。在缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）病理过程中，EAA和IAA类神经递质平衡的破坏，可引发一系列病理生理改变，最终导致神经细胞的凋亡或坏死。因此，调节脑内氨基酸类神经递质的动态平衡是防治IS的重要途径[2]。

对羟基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde，4-HBd）是天麻抗IS作用的主要活性成分之一，对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用，能对抗神经细胞的凋亡[3]。本研究利用微透析采样技术联合HPLC-FLD分析方法考察4-HBd对大鼠MCAO/R模型大鼠脑皮层区氨基酸类神经递质动态变化的影响，探讨其对抗神经细胞凋亡的可能机制。

1 实驗材料

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，SPF级，体重200～240g，由湖南斯莱克景达实验动物有限司提供。生产许可证号SCXK（湘）2016-0002。

1.2 实验试剂 对羟基苯甲醛（纯度99.89%）由北京百灵威科技有限公司提供;谷氨酸（Glu）、天门冬氨酸（ASP）、甘氨酸（Gly）、γ-氨基丁酸（GABA）标准品、邻苯二甲醛（OPA）均由美国Sigma公司提供;MCAO栓线，北京西浓有限公司;水合氯醛，天津市科密欧化学试剂有限公司;四氢呋喃（THF）、2-巯基乙醇（2-MCE）、硼酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 实验仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司;Secura2250分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;XW-80A涡旋混匀振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;BASi微透析仪，美国BASi公司。

2 实验方法

2.1 脑微透析套管植入手术以及脑透析液的采集 取SD大鼠以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，俯卧固定在脑立体定位仪上，用手术恒温加热垫保持大鼠体温在（37±0.5）℃。沿大鼠脑正中剪开头皮，充分暴露头骨。按大鼠脑图谱（Paxinos and Watson，6TH Ediyion），以前囟作为定位基点，右侧大脑皮层区（坐标为AP：+3.2mm;ML：+0.4mm;DV：3.0mm），并植入脑微透析套管。术后观察3d，即可进行采样。

大鼠放置于微透析仪的清醒活动装置内，将脖套与平衡臂相连，以人工脑脊液为灌流液，于0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h进行取样。

2.2 MCAO/R模型的复制 采用线栓法复制大鼠MCAO/R模型[4-5]。复制方法如下：以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，沿颈正中偏右处切口，分离大鼠右侧颈总动脉（CCA）和迷走神经。结扎CCA近心端，并剪一“V”型小口，CCA远心端用动脉夹夹闭，栓线经缺口插入，使尼龙线头端通过大脑中动脉（MCA）起始处，到达较细的大脑前动脉，线栓插入深度为18-20mm，微遇阻力时停止。MCAO后2h时缓慢的轻拉尼龙线使其头端回到颈总动脉内，完成大鼠MCAO/R模型。

2.3 大鼠MCAO/R模型的评价 参照Longa并加以改良的5分法[6]进行评分：模型成功的标准：排除为无症状0分和严重缺损症状4分的大鼠，视评分为1～3分的动物为模型成功。

2.4 实验分组以及给药 将体重在200～240 g的雄性SD大鼠，随机分为正常组和MCAO/R模型组，每组6只。正常组和MCAO/R组大鼠实验前禁食12 h，自由饮水，正常组以1 mL/100 g体积给予4-HBd（灌胃：400 mg/kg）;模型组进行MCAO/R手术，于再灌注2 h后以1 mL/100g体积给予4-HBd（灌胃：400mg/kg）。

2.5 氨基酸类神经递质的测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Eclipse AAA（4.6×150mm 3.5um，美国Agilent公司）;流动相：流动相B为缓冲液：甲醇：四氢呋喃（V：V：V）=800：190：10;流动相C为缓冲液：甲醇（V：V）=240：760，抽滤超声后用。缓冲液为20mM乙酸钠溶液（PH7.2）。检测波长：激发波长：340nm，发射波长：455nm;流速：0.8mL/min;柱温：40℃，进样量：5μL。梯度洗脱程序见表1。

2.5.2 衍生液的配置 精密称取OPA25mg，加入0.5mL甲醇溶解，再加入40μL 2-巯基乙醇、5mL 0.4mol·L-1硼酸-氢氧化钠缓冲液（pH=9.6），避光，0℃～4℃保存。隔日補加10～15μL。

2.5.3 氨基酸衍生进样程序 从样品中抽取5μL：从样品瓶2（超纯水，洗针）抽取0μL;从样品瓶1（衍生液）抽取2.5μL：将7.5μL混合到空气中，最大速度，6次，等待0.5min;从样品瓶2（超纯水，洗针）抽取0μL;进样5μL。

2.6 数据处理 实验数据均以（x±s）表示，采用GraphPad prism5.0 软件进行统计，组间比较采用单因素方差分析法处理，方差齐者采用LSD 法检验，方差不齐者采用Tamhanes 法检验。

3 实验结果

3.1 HPLC-FLD检测条件的考察 在建立的HPLC-FLD检测色谱条件下，脑透析样品中四种氨基酸分离较好，峰形良好，表明此方法具备良好的专属性，HPLC色谱结果见图1。以峰面积积分值（A）为纵坐标Y，以浓度（C）为横坐标X，绘制标准曲线并求得回归方程。结果表明，Asp、Glu、Gly和GABA对照品浓度在范围内与其峰面积呈良好的线性关系，结果见表2。

3.2 4-HBd对MCAO/R模型大鼠脑透析液中Glu动态变化的影响 与假手术组相比，MCAO/R模型组大鼠脑透析液中 Glu释放水平升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组相比，4-HBd可明显下调模型大鼠脑透析液中0.25h～6h、10h～24h Glu的释放水平，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），结果见图2。

3.3 4-HBd对MCAO/R模型大鼠脑透析液中Asp动态变化的影响 结果显示，与假手术组相比，MCAO/R模型组大鼠脑透析液中各时间点Asp释放水平均无明显变化，差异无统计学意义;与模型组相比，4-HBd对模型大鼠脑透析液中各时间点Asp的释放水平无明显影响，差异无统计学意义，结果见图3。

3.4 4-HBd对MCAO/R模型大鼠脑透析液中Gly动态变化的影响 结果显示，与假手术组相比，MCAO/R模型大鼠脑透析液中18h Gly水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），其余各时间点均无明显变化，差异无统计学意义;与模型组相比，4-HBd可明显上调模型大鼠脑透析液中0.25、1.25、2.5、14、18、20h时间点Gly的释放水平，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），无浓度-时间关系，结果见图4。

3.5 4-HBd对MCAO/R模型大鼠脑透析液中GABA动态变化的影响 结果显示，与假手术组相比，MCAO/R模型组大鼠脑透析液中各时间点GABA释放水平均无明显变化，差异无统计学意义;与模型组相比，4-HBd可明显上调模型大鼠脑透析液中0.75、1.25、2.5h时间点GABA的释放水平，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），无浓度-时间关系，结果见图5。

4 讨论

微透析技术具有实时、原位、自动筛选游离态药物，样品分析无需前处理等优点。并且脑微透析液相比传统的脑组织匀浆液，能更加准确、真实的反映特定脑区神经递质的释放情况。本研究利用微透析在非麻醉的MCAO/R模型动物上取样，能较真实地反应IS病理状态下脑内氨基酸类神经递质含量的动态变化[7]，以探讨4-HBd抗神经细胞凋亡的可能机制。研究结果显示MCAO/R模型组大鼠脑透析液中Glu含量明显升高，4-HBd可明显下调MCAO/R模型大鼠皮层区0.25h～6h、10h～24h脑透析液中EAA类Glu的含量，但对Asp含量无明显影响。

在IS病理过程中，缺血缺氧环境引起突触后神经元去极化，释放大量EAA，而其重摄取功能受到抑制，使细胞外EAA大量堆积，EAA主要包括Glu和Asp。 EAA的神经毒性主要表现为：大量K+外流，Na+内流，Cl-及H2O被动内流引起以神经元渗透性水肿为主的急性损伤，诱导神经细胞的凋亡或坏死;另外，EAA通过刺激EAA受体，启动Ca2+通道，Ca2+大量内流，激活一系列依赖于Ca2+的酶系统，造成迟发性神经元变性坏死。作为中枢神经系统内的IAA，主要包括GABA和甘氨酸Gly，可通过突触后膜超极化、减少离子内流、降低细胞代谢及氧消耗，使突触后神经元处于保护性抑制状态，抑制神经元兴奋，减轻细胞损伤[8-11]。IAA虽能对抗EAA毒性，但脑缺血后IAA代偿过度释放，会出现IAA耗竭现象，致使原发性抑制降低，因此IAA在IS时过度释放一直是研究者们存有争议的问题[12-13]。在本研究的实验条件下，MCAO/R模型组大鼠在再灌注24h 内脑透析液中IAA类GABA和Gly的释放水平没有观察到明显变化。

IS时细胞外液中Glu的大量堆积是神经兴奋性毒性的源头，是引起神经元渗透性水肿、迟发性神经元变性坏死、神经元凋亡等一系列神经损伤[14-15]的重要因素。为此，4-HBd的抗神经细胞凋亡的作用可能与降低EAA类神经递质Glu含量有关。

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（收稿日期：2020-05-04）