刘冲英，蒲定涛，任佳妮，李 瑾，张丽华，赵 鹏

(陕西中医药大学药学院 陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 西安 712046)

中药地黄是玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的根，根据其入药形式可将其分为鲜地黄、生地黄、熟地黄、地黄炭等。地黄最早记载于《神农本草经》中，具有滋阴、补血、降血糖等功效，被列为补益类中药的上品[1]。研究发现，多糖是地黄的重要活性成分之一，具有增强免疫功能、抗肿瘤及促进造血功能等多种生物活性[2-8]，还具有抗脂质过氧化作用[9]，能够抑制过氧化氢引起的细胞损伤[10]，用途十分广泛。

在提取地黄多糖的过程中，地黄含有的色素同时被提取出来，使得地黄多糖呈棕黄色，这既影响了地黄多糖的纯度，还给地黄多糖的纯化、分析及质量控制带来了很大困难，极大地影响了其活性，因此，脱色是提高地黄多糖产品品质的关键工艺。目前，常用于多糖脱色的方法有：双氧水法[11]、大孔吸附树脂法和活性炭法[12-15]，相比较而言，双氧水法具有条件温和、操作简便、脱色率高等优点，因而被广泛应用于多糖的脱色处理[16]。目前，对地黄多糖的研究主要集中在河南、湖北等道地产区所产地黄多糖，而对于陕产地黄多糖的研究还未见报道，对地黄多糖的抗氧化活性研究也鲜有报道。基于此，作者在单因素实验的基础上，采用响应面法对陕产地黄多糖双氧水法脱色工艺进行优化，并对纯化后的地黄多糖抗氧化活性进行评价，以期为深度开发陕产地黄提供帮助。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

地黄粗多糖(已脱除蛋白)，自制。

2,2-联苯基-1-苦肼基(DPPH)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%双氧水、氨水、盐酸羟胺、浓硫酸、邻苯三酚、苯酚、邻二氮菲等均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

HHS型恒温水浴锅，巩义予华仪器厂；UV1102型紫外可见分光光度仪，上海天美科学仪器有限公司；FA2004型电子天平，上海民桥精科天平厂。

1.2 脱色实验

配制15 mg·mL-1的地黄粗多糖溶液50 mL，按一定体积比(双氧水与地黄粗多糖体积比)加入30%双氧水，调节pH值后，置于一定温度的水浴中，搅拌下保温一段时间，于3 000 r·min-1离心10 min，上清液浓缩后醇沉、过滤，滤饼烘干，即得脱色的地黄多糖。

以地黄多糖脱色率和多糖保留率为评价指标，通过单因素实验研究双氧水与地黄粗多糖体积比、脱色温度、pH值、脱色时间对地黄多糖脱色效果的影响，再通过响应面法优化脱色工艺。

1.3 抗氧化实验

1.3.1 清除羟基自由基的能力

参照文献[17]的实验方法略加调整后进行。先配制浓度(mg·mL-1)分别为0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00 等8个样品溶液；分别取1.0 mL，依次加入1.5 mL 7.5 mol·L-1硫酸亚铁溶液、3.0 mL 8.0 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液和3.0 mL 7.5 mmol·L-1双氧水溶液，混匀，在37 ℃下反应45 min，测定溶液在510 nm 处吸光度；以VC为阳性对照。按式(1)计算羟基自由基清除率(%)：

(1)

式中：A0为不加样品的空白对照的吸光度；Ai为加入样品后的吸光度。

1.3.2 清除超氧阴离子自由基的能力

参照文献[17]的实验方法略加调整后进行。按1.3.1配制样品溶液；分别取0.2 mL，加入3.0 mL pH值为8.2的0.05 mmol·L-1Tris-HCl 缓冲液，混匀，在25 ℃下反应10 min；再加入12 μL 30 mmol·L-1邻苯三酚溶液，反应4 min，测定溶液在320 nm 处吸光度；以VC为阳性对照。按式(2)计算超氧阴离子自由基清除率(%)：

(2)

式中：A0为不加样品的空白对照的吸光度；Ai为加入样品后的吸光度；Ab为Tris-HCl 缓冲液的吸光度。

1.3.3 清除DPPH自由基的能力

参照文献[17]的实验方法略加调整后进行。按1.3.1配制样品溶液；分别取70 μL，加入180 μL 0.04 mg·mL-1的DPPH自由基乙醇溶液，混匀，在27 ℃下暗处反应5 min，测定溶液在517 nm处吸光度；以不加样品的DPPH自由基溶液为空白，以VC为阳性对照。按式(3)计算DPPH自由基清除率(%)：

(3)

式中：A0为不加样品的空白对照的吸光度；Ai为加入样品后的吸光度。

1.4 计算方法

1.4.1 脱色率的计算

配制1 mg·mL-1的地黄多糖水溶液，在波长200～600 nm范围内对地黄多糖水溶液进行紫外可见光全波段扫描。结果发现，在该波段范围内，地黄多糖无明显的最大吸收。由于多糖溶液呈深棕色，从溶液的互补色考虑，确定450 nm为检测波长[18]。按式(4)计算脱色率(Y1，%)：

(4)

式中：A前、A后分别为地黄多糖脱色前后的吸光度。

1.4.2 多糖保留率的计算

采用苯酚-硫酸法[19]测定地黄多糖的含量，按式(5)计算多糖保留率(Y2，%)：

(5)

式中：M前、M后分别为脱色前后的地黄多糖含量。

1.4.3 综合评分的计算

以脱色率(Y1)和多糖保留率(Y2)为评价指标，根据综合评判公式(6)计算综合评分(OD值)：

OD值=MY1+NY2

(6)

式中：M、N分别为Y1和Y2的权重系数，M=N=0.5[20]。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 双氧水与地黄粗多糖体积比对脱色效果的影响

在地黄粗多糖溶液pH值为7.0、脱色温度为40 ℃、脱色时间为90 min的条件下，按不同体积比加入30%双氧水进行脱色实验，考察双氧水与地黄粗多糖体积比对地黄多糖脱色效果的影响，结果如图1所示。

图1 双氧水与地黄粗多糖体积比对脱色效果的影响Fig.1 Effect of volume ratio of hydrogen peroxide to crude polysaccharides on decolorization efficiency

由图1可知，当双氧水与地黄粗多糖体积比小于2.0∶1时，随着双氧水用量的增加，地黄多糖脱色率快速升高；当双氧水与地黄多糖体积比超过2.0∶1后，脱色率基本稳定。在整个脱色过程中，多糖保留率变化不大。因此，确定适宜的双氧水与地黄粗多糖体积比为2.0∶1。

2.1.2 脱色温度对脱色效果的影响

在双氧水与地黄粗多糖体积比为2.0∶1、pH值为7.0、脱色时间为90 min的条件下，在不同温度下进行脱色实验，考察脱色温度对地黄多糖脱色效果的影响，结果如图2所示。

图2 脱色温度对脱色效果的影响Fig.2 Effect of decolorization temperature on decolorization efficiency

由图2可知，随着脱色温度的升高，地黄多糖脱色率快速升高，当脱色温度达到45 ℃时，脱色率达到最高；继续升高脱色温度，脱色率反而明显下降。这说明温度的升高有助于提高双氧水的活性，脱色率相应升高；但当温度过高时，双氧水会发生分解，从而降低了脱色能力。同时，随着脱色温度的升高，多糖保留率呈下降趋势。综合考虑，确定适宜的脱色温度为45 ℃。

2.1.3 pH值对脱色效果的影响

在双氧水与地黄粗多糖体积比为2.0∶1、脱色温度为45 ℃、脱色时间为90 min的条件下，在不同pH值下进行脱色实验，考察pH值对地黄多糖脱色效果的影响，结果如图3所示。

图3 pH值对脱色效果的影响Fig.3 Effect of pH value on decolorization efficiency

由图3可知，当pH值低于8.0时，随着pH值的增大，地黄多糖脱色率快速升高；当pH值达到8.0后，脱色率又随着pH值的增大逐渐下降。这说明在弱碱性条件下，地黄多糖的脱色效果较好。同时，多糖保留率在酸性条件下较低，随着pH值的增大，多糖保留率逐渐升高，在pH值为7.0时达到最高；随着pH值的继续增大，多糖保留率呈下降趋势。综合考虑，确定适宜的pH值为8.0。

2.1.4 脱色时间对脱色效果的影响

在双氧水与地黄粗多糖体积比为2.0∶1、脱色温度为45 ℃、pH值为8.0的条件下，考察脱色时间对地黄多糖脱色效果的影响，结果如图4所示。

图4 脱色时间对脱色效果的影响Fig.4 Effect of decolorization time on decolorization efficiency

由图4可知，随着脱色时间的延长，地黄多糖脱色率逐渐升高；在脱色时间达到120 min时，脱色率达到最高；继续延长脱色时间，脱色率反而缓慢下降。同时，随着脱色时间的延长，多糖保留率一直呈下降趋势。综合考虑，确定适宜的脱色时间为120 min。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 结果分析

根据单因素实验结果，双氧水与地黄粗多糖体积比、脱色温度、pH值和脱色时间这4个因素对地黄多糖脱色效果的影响均比较大，但由于双氧水与地黄粗多糖体积比在达到2.0∶1时对脱色效果影响不大，无须对其再进行优化。因此，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选择脱色温度(X1)、pH值(X2)、脱色时间(X3)为自变量，以脱色率(Y1)和多糖保留率(Y2)的综合评分(OD值)为响应值，通过响应面优化软件，对地黄多糖脱色工艺进行优化。响应面实验的因素与水平见表1，方案设计与结果见表2。

表1 因素与水平

运用Design-Expert v7.1.3软件，对表2数据进行回归拟合分析，得到模型方程为：Y=0.83-0.057X1+0.018X2+(4.087E-003)X3+(2.250E-003)

表2 方案设计与结果

表3 方差分析

2.2.2 等高线图和响应面图分析

通过等高线图和响应面图可直观地看出各因素交互作用影响的显著性。如果两个因素之间的交互作用影响不显著时，得到的响应面图趋于圆形；反之，如果两个因素之间的交互作用影响显著，则得到的响应面图趋于椭圆形。脱色温度、pH值、脱色时间等3个因素之间的交互作用对地黄多糖脱色效果影响的等高线图和响应面图如图5所示。

图5 各因素交互作用对脱色效果影响的等高线图和响应面图Fig.5 Contour plot and response surface plot of effect of interaction between each factors on decolorization efficiency

由图5可知：脱色温度与pH值、脱色温度与脱色时间的交互作用对脱色效果的影响不大；3个因素对应的曲线中，变化最大的是代表脱色温度的曲线，最为密集陡峭，说明脱色温度的改变会引起OD值的显著变化，其次是pH值，影响最小的是脱色时间。

对二次多项回归方程进行极值分析，可预测地黄多糖最优的脱色工艺条件为：脱色温度43.26 ℃、pH值8.16、脱色时间116.32 min，预估的最大OD值为0.841 3。为了检验响应面实验预测得到的工艺条件的可靠性，在上述条件下进行3次地黄多糖脱色平行实验，考虑到实验的可操作性，将预测的工艺条件微调成：脱色温度43 ℃、pH值8.2、脱色时间116 min，得到脱色率为88.03%，多糖保留率为77.56%，计算得到OD值为0.827 8。通过响应面实验预测的理论值与平行实验的实测值误差较小，表明拟合得到的二次多项回归模型可以较好地预测因素与响应值之间的影响关系。

2.3 地黄多糖的抗氧化活性

2.3.1 对羟基自由基的清除活性(图6)

图6 地黄多糖对羟基自由基的清除活性Fig.6 Scavenging activity of polysaccharides fromRehmannia glutinosa Libosch. to hydroxyl free radicals

由图6可知，地黄多糖对羟基自由基具有一定的清除能力，在其浓度为2.50 mg·mL-1时清除率达到最高，为56.62%；而地黄粗多糖在浓度为1.50 mg·mL-1时清除率达到最高，为42.13%。表明，经过纯化，地黄多糖清除羟基自由基的能力有了一定提高。

2.3.2 对超氧阴离子自由基的清除活性(图7)

图7 地黄多糖对超氧阴离子自由基的清除活性Fig.7 Scavenging activity of polysaccharides from Rehmannia glutinosa Libosch. to superoxide anion free radicals

由图7可知，地黄多糖对超氧阴离子自由基具有较好的清除能力，在其浓度为2.00 mg·mL-1时清除率达到最高，为75.51%；而地黄粗多糖在浓度为2.00 mg·mL-1时，对超氧阴离子自由基的清除率仅为57.22%。表明，经过纯化，地黄多糖清除超氧阴离子自由基的能力有了明显提高。

2.3.3 对DPPH自由基的清除活性(图8)

图8 地黄多糖对DPPH自由基的清除活性Fig.8 Scavenging activity of polysaccharides from Rehmannia glutinosa Libosch.to DPPH free radicals

由图8可知，地黄多糖对DPPH自由基具有一定的清除能力，在其浓度为1.50 mg·mL-1时清除率达到最高，为54.66%；而地黄粗多糖在浓度为2.50 mg·mL-1时清除率达到最高，为42.13%。表明，经过纯化，地黄多糖清除DPPH自由基的能力有了一定提高。

抗氧化实验结果表明，纯化有助于提高地黄多糖的抗氧化活性，随着地黄多糖的进一步纯化，其抗氧化活性有可能进一步提高。

3 结论

在单因素实验的基础上，采用响应面法优化了地黄多糖双氧水法脱色工艺。在双氧水与地黄粗多糖体积比为2.0∶1、脱色温度为43 ℃、pH值为8.2、脱色时间为116 min的最优条件下，地黄多糖脱色率达到88.03%，多糖保留率为77.56%；纯化后的地黄多糖的抗氧化活性有了一定程度的提高。表明，双氧水法适用于陕产地黄多糖的脱色，可进行工业化应用。陕产地黄多糖具有较高的抗氧化活性，但其抗氧化活性是否与血糖血脂的调节、免疫功能的改善等作用机制有关联还需进一步研究。本研究为陕产地黄的深入开发利用提供了一条新的途径。