吕亭亭，杨志华，谢 奇，叶翩翩，陶 娟，刘 旭*

(1.江苏护理职业学院药学与中药学院，江苏 淮安 223005；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300381)

泡桐(Paulowniafortunei)，多年生落叶乔木，是玄参科泡桐属的简称。我国泡桐资源丰富，种类繁多，在黄河流域被用作传统医药数百年[1]。由于泡桐具有易繁殖、生长速度快、材质较好的特点，已被许多国家引种栽培，主要应用于生态绿化和工农业生产。泡桐不但具有较高的经济价值而且具有重要的药用价值，泡桐植物的根、花、叶、皮、果均可入药，具有抗氧化[2]、抗菌[3-4]、抗病毒[5]等药理活性。泡桐花(PaulowniaFlos)即为泡桐的花，主要含有黄酮类、苯丙素类、萜类、糖类等活性成分，具有清热解毒、疏风散热、燥湿止痢、清肝明目之功效[6-7]。泡桐花总黄酮具有抗菌[8]、抗炎[9]、抗病毒[10-11]、抗氧化[12]、增强免疫力[13]等生物活性，受到人们的广泛关注。目前，测定植物中总黄酮含量的方法主要有高效液相色谱法和比色法[14]，其中高效液相色谱法操作繁琐，主要用于测定黄酮单体，不适于总黄酮的含量测定；而亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法和三氯化铝比色法由于操作简单、实用性强，在总黄酮含量测定中被广泛使用[15-17]。

作者以芦丁为对照品，通过比较亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系和三氯化铝显色体系对总黄酮的吸收特性，筛选泡桐花总黄酮含量测定的合适方法，并对该方法进行方法学验证；在单因素实验的基础上，采用正交实验对该方法的显色时间进行优化，为泡桐花总黄酮含量测定方法的研究提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

泡桐花，购自河南兰考中草药市场，经鉴定属玄参科泡桐属植物。用多功能粉碎机粉碎成300 目，备用。

芦丁对照品(纯度≥98%)，合肥博美生物科技有限责任公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铝等均为分析纯，无锡亚盛化工有限公司。

BF-10型多功能粉碎机，河北本辰科技有限公司；UV1800型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；HH-2型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；BSA型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 溶液的制备

1.2.1 显色试剂的配制

5%NaNO2溶液：称取亚硝酸钠2.5 g，溶于50 mL蒸馏水中。

10%Al(NO3)3溶液：称取硝酸铝5 g，溶于50 mL蒸馏水中。

1.0 mol·L-1NaOH溶液：称取氢氧化钠4.0 g，溶于100 mL蒸馏水中。

0.1 mol·L-1AlCl3溶液：称取三氯化铝1.34 g，溶于100 mL蒸馏水中。

1.2.2 对照溶液的配制

取芦丁对照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解，定容至刻度，即得200 μg·mL-1对照溶液。

1.2.3 供试溶液的制备

称取泡桐花粉末2.0 g，置于圆底烧瓶中，加入60%乙醇50 mL，90 ℃加热回流提取2.0 h，冷却，补重，离心，取20 mL上清液，用60%乙醇稀释至50 mL，即得供试溶液。

1.3 泡桐花总黄酮含量测定方法的筛选

1.3.1 亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[18-19]

精密量取供试溶液1.00 mL和对照溶液2.00 mL，分别置于烧杯中；各加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，摇匀，静置6 min；再各加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min；最后各加3.0 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液，用蒸馏水定容至10 mL，静置15 min；以空白试剂作为参比，用紫外可见分光光度计在400～600 nm波长范围内扫描吸收曲线。

1.3.2 三氯化铝比色法[20]

精密量取供试溶液1.00 mL和对照溶液2.00 mL，分别置于烧杯中；各加入2.0 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液，用蒸馏水定容至10 mL，静置30 min；以空白试剂作为参比，用紫外可见分光光度计在300～500 nm波长范围内扫描吸收曲线。

1.4 显色时间的优化

1.4.1 单因素实验[16,19,21]

前期实验发现，3种显色试剂NaNO2、Al(NO3)3、NaOH的加入比例约为1∶1∶10。所以，测定泡桐花总黄酮含量时只要控制好3种显色试剂的加入比例即可，试剂的加入量对吸光度的影响不大。为此，只需考察3种显色试剂的静置时间(显色时间)对吸光度的影响。量取2 mL供试溶液，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定泡桐花总黄酮含量，考察NaNO2显色时间(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)、Al(NO3)3显色时间(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)、NaOH显色时间(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)对吸光度的影响。

1.4.2 正交实验

在单因素实验的基础上，选取NaNO2显色时间(A)、Al(NO3)3显色时间(B)、NaOH显色时间(C)作为考察因素，以泡桐花总黄酮含量为考核指标进行3因素3水平L9(34)正交实验，优化泡桐花总黄酮含量的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定条件。正交实验的因素与水平见表1。

表1 正交实验的因素与水平

2 结果与讨论

2.1 泡桐花总黄酮含量测定方法的确定

分别采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系和三氯化铝显色体系对供试溶液和对照溶液进行显色，用紫外可见分光光度计在一定波长范围内扫描吸收曲线，结果如图1所示。

从图1可知，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系，对照溶液和供试溶液的吸收峰几乎重合，最大吸收波长为500 nm；采用三氯化铝显色体系，对照溶液和供试溶液的最大吸收波长差异较大。因此，选择亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定泡桐花总黄酮含量，检测波长为500 nm。

图1 采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系(a)和三氯化铝显色体系(b)的紫外可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis absorption spectra of solutions colored by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH chromogenic system(a) and AlCl3 chromogenic system(b)

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线及线性范围

精密量取对照溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系，用紫外可见分光光度计测定500 nm处吸光度，以芦丁溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线(图2)，拟合得线性方程为y=9.315x-0.0353，R2=0.9998。表明芦丁浓度在0.02～0.10 mg·mL-1范围内与吸光度线性关系良好。

图2 芦丁的标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

2.2.2 重复性

分别称取6份泡桐花样品各2.0 g，按1.2.3方法制备供试溶液，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系，用紫外可见分光光度计测定500 nm处吸光度，每个样品平行测定3次，取平均值。计算泡桐花总黄酮含量分别为3.66%、3.71%、3.76%、3.64%、3.68%、3.72%，平均含量为3.70%，RSD为1.08%，小于3.0%，表明亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法重复性良好。

2.2.3 精密度

称取泡桐花样品2.0 g，按1.2.3方法制备供试溶液，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系，用紫外可见分光光度计测定500 nm处吸光度，连续测定6次。计算泡桐花总黄酮含量分别为3.52%、3.63%、3.67%、3.53%、3.64%、3.66%，平均含量为3.61%，RSD为1.67%，小于3.0%，表明亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法精密度良好。

2.2.4 稳定性

称取泡桐花样品2.0 g，按1.2.3方法制备供试溶液，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系，分别在0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min取样，用紫外可见分光光度计测定500 nm处吸光度，每个样品平行测定3次，取平均值，分别为0.528 0、0.527 2、0.526 8、0.526 1、0.521 2、0.518 1、0.512 0。表明泡桐花样品溶液采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系显色后吸光度在0～30 min内稳定性良好。

2.2.5 准确度

分别称取6份泡桐花样品各2.0 g，分别加入0.076 2 g芦丁对照品，按1.2.3方法制备供试溶液，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系，用紫外可见分光光度计测定500 nm处吸光度，每个样品平行测定3次，取平均值，计算泡桐花总黄酮的加标回收率及RSD，结果见表2。

从表2可知，泡桐花总黄酮的加标回收率在99.2%～105.5%之间，RSD为2.18%，小于3.0%，表明亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法准确度良好。

表2 泡桐花总黄酮的加标回收率

2.3 显色时间优化

2.3.1 单因素实验结果

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定泡桐花总黄酮，3种显色试剂的显色时间对吸光度的影响见表3。

表3 3种显色试剂的显色时间对吸光度的影响

从表3可知，加入不同显色试剂后，随着显色时间的延长，吸光度均逐渐减小并趋于稳定。在加入显色试剂NaNO2、Al(NO3)3、NaOH后，分别静置6 min、6 min、15 min后吸光度稳定。

2.3.2 正交实验结果

根据单因素实验结果，分别以6 min、6 min、15 min为NaNO2显色时间(A)、Al(NO3)3显色时间(B)、NaOH显色时间(C)的中心点，采用L9(34)正交实验优化亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法显色条件，结果与分析见表4。

从表4可知，因素A对总黄酮含量影响最大，其次是因素B，影响最小的是因素C；测定泡桐花总黄酮含量的最佳显色条件为A2B2C1，即NaNO2显色时间6 min、Al(NO3)3显色时间6 min、NaOH显色时间10 min。

2.4 泡桐花总黄酮含量的测定

分别称取6份泡桐花样品各2.0 g，按1.2.3方法制备样品溶液，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系在优化条件下进行显色反应，用紫外可见分光光度计测定500 nm处吸光度，每个样品平行测定3次，取平均值，计算泡桐花总黄酮的平均含量为3.78%，RSD为2.05%。说明该方法测定泡桐花总黄酮稳定可行。优化的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法简便、快速、准确，可作为泡桐花总黄酮含量的测定方法。

3 结论

通过单因素实验和正交实验确定亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定泡桐花总黄酮较为合适，该方法的重复性、精密度、稳定性和准确度均较好，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等3种显色试剂的最佳显色时间分别为6 min、6 min、10 min，在此条件下测定的泡桐花总黄酮平均含量为3.78%，RSD为2.05%。