卢 波， 刘炳昊

（新乡市中心医院口腔二科，河南 新乡453000）

良好的口腔种植体对修复缺损、促进种植体-骨组织界面骨细胞长入具有重要作用。种植体材料不仅要耐磨损，有较好的生物相容性[1]，还应有较好的细胞增殖和分化的诱导作用，从而减少细胞凋亡，维持骨形成和吸收的动态平衡[2]。传统口腔种植体材料以钛和钛合金为主，优点是生物相容性好、强度高[3]，缺点是诱导成骨细胞长入时间长，材料弹性模量与骨组织匹配度较差，易导致应力集中性损坏，种植体松动、移位、不愈合等问题，从而影响了种植体的稳定性[4]。钽金属同样有较好的生物相容性和理化性质，表面有不同直径的孔隙，能够较好地诱导细胞长入，促进骨整合[5]。纳米级别的钽涂层应用于种植体表面可以适应牙齿正常咬合和咀嚼的需要，其应力分散、强度大、稳定性好[6]；骨愈合时间短，种植体与骨组织易融合，并发症较少，是理想的种植体材料[7]。本研究旨在评价纳米钽种植体颗粒对成骨细胞增殖能力，以及对ALP、BMP-2、OCN基因表达的影响，为口腔种植材料的选择提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料来源

钽颗粒（美国Sigma公司）、成骨细胞系MC3T3-E1（美国R&D公司）在含10%胎牛血清（北京中杉金桥生物有限公司）+1%双抗的α-MEM培养基上接种，于37℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞融合达85%时进行消化，传代培养。

1.2 实验分组和方法

钽颗粒经钴60-γ射线辐照消毒、超声乳化制成1 mg/mL纳米钽母液，经透射电镜和扫描电镜进行颗粒形态和粒径大小的表征。然后将纳米钽母液配制成3种质量浓度的溶液，即10 ng/mL、10μg/mL和100μg/mL。分别将其与成骨细胞系MC3T3-E1共培养。采用CCK8法检测不同培养时间的细胞增殖 率，PCR法 检 测 细 胞 分 泌ALP、BMP-2和OCN mRNAs的表达水平。

CCK8法：调 整 细 胞 浓 度 为1×103个/孔，将MC3T3-E1细胞接种于96孔板中，每组设6个复孔，设置空白对照，分别与3种质量浓度的纳米钽溶液共培养6、12、24 h。根据CCK8试剂说明书，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，换算成细胞增殖率（与空白对照组的比值）。

PCR法：设计各目标基因序列。ALP：正向5′-CCAAGTAGTTAGGCTTATTG-3′，反 向5′-TTACCATTCCCATTTCTTCAA-3′，123 bp；BMP-2：正向5′-CAATTCCGTGCTCTTCTTAA-3′，反 向5′-AACCCACTCAAATCTGAAAGTTAA-3′，96 bp；OCN：正向5′-TTCAGGCGCAACCTGTATCTT，反向5′-GGTCTT CCAACTAATCACAGTT-3′，253 bp；GAPDH:正向5′-TGGTTAACAGCCCAATGCC，反向5′-CTAAGTCAT AGTTTGTTTAGCCGAA，63 bp。根据TRIzol试剂盒提示采用一步法提取细胞总RNA，检测浓度和纯度，经反转录合成cDNA，为PCR扩增模板。参照Takara Ex Taq试剂盒说明书制备反应液，为TaqⅡ（10μL）+上、下游引物（各0.8μL）+cDNA（2.5μL）+反应水至总体积为20μL。反应条件为95℃30 s预变形，95℃5 s、20℃/s变性，40次循环扩增，60℃20 s、20℃/s退火，72℃30 s延伸。电泳鉴定产物行半定量分析。

1.3 观察指标

比较3种质量浓度的细胞在培养6、12、24 h后的细胞增殖率，ALP、BMP-2和OCN mRNAs表达水平。

1.4 统计学方法

以SPSS 20.0软件对不同时间点的计量资料作重复测量的方差分析，两两比较采用LSD-t法检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电镜表征结果

对纳米钽母液中的颗粒表面进行电镜表征，结果显示，纳米钽形状较规则，呈圆球形，粒径为8～15 nm，平均水合粒径为（286.5±13.6）nm，见图1。

图1电镜表征纳米钽母液中的颗粒表面Figure 1 TEM and SEM images showing particle surface in nano-tantalum mother liquor

2.2 各组不同培养时间的细胞增殖率

组内比较发现，3组培养12 h后的细胞增殖率较培养6 h后明显升高（P＜0.05），培养24 h后较培养12 h后减少（P＜0.05），但仍高于培养6 h后（P＜0.05）；组间比较发现，10μg/mL组3个时间点的细胞增殖率均明显高于其他2组（P＜0.05）。详见表1。

表1各组不同培养时间的细胞增殖率（%）Table 1 Cell proliferation rate of different culture time in each group(%)

2.3 各组不同培养时间ALP、BMP-2和OCN mRNAs表达水平

培养12 h后，3组ALP、BMP-2及OCN mRNAs的表达水平明显高于6 h（P＜0.001），培养24 h后下降，但仍高培养6 h后（P＜0.001）；组间比较发现，10μg/mL组 不 同 时 间 点ALP、BMP-2及OCN的mRNAs水平明显高于其他两组（P＜0.001）。详见图2。

3 讨论

3.1 钽种植体的理化特性研究

种植体材料的机械性能和生物相容性是影响种植效果的主要因素[8-9]。钽金属具有很强的耐蚀性能，生物相容性佳，生物组织易在钽表面生长，并能够诱导成骨细胞增殖、分化和矿化等行为。成骨细胞是种植体界面较活跃的细胞，对实现骨组织重建发挥重要作用[10-11]。

目前，关于钽种植体在临床中应用的经验较少。美国杰美系统前期研究证实，普通种植体需要3个月才能够受力，而钽种植体只需2～4周[12]。应用钽种植体2周可以负重，种植后2个月可以戴牙，时间大大缩短[13]，具有良好的应用前景。

3.2 纳米钽的基础研究

实验研究中多采用化学气相渗透沉积法和粉末冶金法制备钽金属。钽的弹性模量（1.3～10.0 GPa）与人体正常骨质相近，能够有效降低应力遮挡，减少种植体松动、移位的风险，促进周围骨组织生长，减少骨质流失[14]；钽的孔隙率较高，约为75%～85%，高于钛金属网（40%～50%），能够较好地促进营养物质交换，增加骨细胞长入，促进骨整合效率，提高种植体稳定性[15]；钽涂层摩擦系数较高，约为40%～75%，提高了种植体的耐用性[16]。

本研究重点分析纳米钽种植体颗粒对成骨细胞的增殖能力，对ALP、BMP-2及OCN基因表达的影响。结果发现，电镜表征粒径约为8～15 nm，平均水合粒径为（286.5±13.6）nm，证实成功制备纳米钽。部分研究推测，纳米材料的大小可能与人体骨组织的形貌和化学特性更加接近，可以直接调控细胞外基质蛋白的组成、构象和细胞行为，影响成骨和破骨细胞的生物学功能[17-18]。

本研究发现，3组培养12 h后的细胞增殖率，ALP、BMP-2和OCN mRNAs水平最高，且10μg/mL组的水平明显高于其他2组，提示纳米钽种植体与成骨细胞接触后有较好的增殖诱导作用，且与其颗粒大小及浓度有关。纳米钽和微米钽都有较好的促进成骨细胞增殖的特性，纳米钽有介导细胞自噬的作用[19]，而微米钽则可能通过其他途径来完成。钽涂层种植体比钛种植体的骨整合能力更强，在促进成骨细胞黏附和聚集，诱导细胞增殖和分化，降低细胞凋亡等微观生理行为方面表现更突出[20]。长期牙齿应力负荷会增加涂层颗粒的磨损，导致表面钽颗粒脱离，与界面骨细胞直接接触，进而影响成骨和破骨细胞的功能活跃程度[21]。

图2各组不同培养时间ALP、BMP-2及OCN mRNAs的表达水平Figure 2 Expression levels of ALP,BMP-2 and OCN mRNAs in three groups at different culture time

随着培养时间的延长，各组的细胞增殖能力逐渐增强，ALP、BMP-2和OCN mRNAs表达水平也逐渐升高，提示成骨细胞活性增强。既往研究多探讨多孔钽、钽薄膜、钽涂层等对成骨细胞生物学行为的影响，未直接涉及钽颗粒与细胞接触的机制[22-23]。细胞培养至12 h时可达增殖峰值和分化峰值，之后逐渐降低，但仍高于6 h，提示细胞与钽种植体直接接触需要一定的适应时间。峰值的到达时间可能与细胞间抑制、培养液容量或钽种植体-骨组织界面负荷受限有关[24]，其中钽表面孔径数量、孔径大小也可能限制细胞的持续增殖[25]。纳米大小的钽颗粒可能直接影响细胞的骨架张力和重组能力，黏附于纳米钽表面的细胞成分，尤其是成骨细胞，其内部应力经整合素传递给细胞骨架，触发一系列的级联反应，可改变多种影响细胞增殖和分化的基因、蛋白的表达，如ALP、BMP-2和OCN[26-27]。此外，钽直径的大小，纳米钽溶液的浓度都会对细胞增殖和分化行为产生影响。本研究显示，10μg/mL组较10 ng/mL、100μg/mL组细胞增殖明显，可能与纳米钽种植体与细胞的总接触面积大小有关。10μg/mL的质量浓度可能已达到最大负荷，继续增加质量浓度可能会诱导纳米钽材料之间、纳米钽与细胞间，以及细胞之间的相互排斥作用[28]。具体机制有待进一步分析。

本研究以ALP、BMP-2和OCN mRNAs为定量指标反映成骨细胞的增殖能力。ALP的分泌来源主要在骨和肝脏细胞，通常作为衡量成骨细胞早期分化的特异性指标，也是影响骨骼矿化程度的重要活性因子，其表达水平与成骨细胞的增殖和分化能力密切相关[29]。BMP-2属于转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的家族成员，是影响骨髓间充质干细胞定向分化，调节成骨细胞增殖活性的重要细胞因子，同时也参与组织器官的形成和发育[30]。OCN是成骨细胞分化的特异性产物，可维持骨的正常矿化，反映成骨细胞活性和骨转换水平[31]。

综上所述，纳米钽种植体对成骨细胞有较好的增殖诱导作用，且呈一定的浓度依赖性。本研究的意义提示了钽金属在口腔种植体材料中的应用特性，其机械性能和生物活性较传统钛金属表现更佳；且纳米钽在促进成骨细胞增殖和分化方面可能与钽金属孔径的大小及浓度有关。本研究的不足在于未能深入证实纳米钽对成骨细胞的长入和融合的情况。宏观上讲，纳米钽能促进种植体的稳定和骨愈合，下一步可采用动物模型进行进一步验证。