金 杯 戴盼盼 孙 旺 顾卫燕 林海升 施更生

EffectofMethylglyoxalontheApoptosisofOsteoblasticCellsbyROS-MCUSignalingPathway.JinBei,DaiPanpan,SunWang,etal.DepartmentofStomatology,TaizhouHospital,WenzhouMedicalUniversity,Zhejiang317000,China

AbstractObjectiveTo explore the effect and mechanism of methylglyoxal (MG) on osteoblast apoptosis through ROS-MCU signaling pathway.MethodsLogarithmic growth phase MC3T3-E1 were divided into 4 groups: control group,MG group, NAC group, NAC+MG group. Cell viability was evaluated by MTT assays. The apoptosis rate was analyzed by flow cytometry and TUNEL assays. The protein expression level of MCU was detected by western blotting.ResultsAs compared with control group, MG decreased the number of viable cells．Flow cytometric analysis, TUNEL staining showed an increase in the incidence of apoptosis. What′s more, MG increased the expression of MCU. As expected, NAC pretreatment greatly improved the viability of cells exposed to MG and attenuated MG-induced apoptosis. Furthermore, NAC treatment markedly decreased level of MCU.ConclusionMG induced osteoblast apoptosis, possibly by regulating ROS-MCU signaling pathway.

KeywordsDiabetic periodontitis; Methylglyoxal; ROS; MCU; Apoptosis

牙周炎作为国内外常见慢性口腔疾病，其全球成人发生率已达50%[1]。目前，牙周炎与全身系统性疾病间的相互影响已经成为牙周医学的研究热点。其中，糖尿病作为严重影响人类健康的三大疾病之一，能增加牙周炎的易感性和严重性，影响疾病进程。牙槽骨破坏是牙周炎的重要病理特征，是造成牙齿松动和脱落的直接原因。研究揭示细胞凋亡在糖尿病性牙周炎中起着关键作用[2]。成骨细胞是骨代谢的中枢细胞，能够抑制破骨细胞的形成，并分化为骨细胞形成骨网络结构来维持机械应力，其凋亡的发生贯穿牙周炎的发生、发展，在牙周炎牙槽骨吸收中起着重要作用。甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)是糖酵解过程中一种有毒代谢产物，研究发现牙周炎患者的龈沟液中MG水平较正常者高达15～20倍，与福赛类杆菌数量呈正比[3]。此外，糖尿病患者血浆中MG浓度明显增高，其与糖尿病以及肾病、心血管病、白内障等多种糖尿病并发症密切相关。

糖尿病病理状态下，体内活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)增加，抗氧化系统受抑制，氧化还原系统失衡形成氧化应激。线粒体不仅是细胞内ROS的主要来源，同时还是ROS攻击的主要靶点。线粒体功能障碍与牙周炎细胞凋亡密切相关，活性氧自由基导致的氧化应激状态下线粒体功能障碍诱导成骨细胞凋亡[2]。而线粒体钙单向转运蛋白(mitochondrial calcium uniporter，MCU)作为线粒体Ca2+的关键调控者，与糖尿病的发生密切相关，并且可由ROS调控诱导细胞凋亡[4]。目前，对于ROS以及MCU是否参与MG诱导成骨细胞凋亡的发生，并且在该过程中发挥怎样的作用未见相关报道。本研究拟构建MG诱导成骨细胞凋亡模型，观察ROS-MCU途径在其中作用，为糖尿病牙周炎的治疗奠定基础。

材料与方法

1.材料：α-MEM细胞培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，甲基乙二醛、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、β-actin一抗(美国Sigma公司)，MCU一抗(美国Cell Signaling Technology公司)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美国Invitrogen公司)，TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司)，二抗(上海碧云天生物技术有限公司)。

2.细胞培养：小鼠MC3T3-E1细胞系购自美国ATCC细胞库，将细胞培养于含10%胎牛血清和100U/ml青霉素G和100ng/ml链霉素的α-MEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱，待细胞长至70%～80%融合时，用胰蛋白酶消化传代。

3.细胞处理：对照组用α-MEM培养基培养；MG组MC3T3-E1细胞用半数抑制浓度的MG培养24h；NAC组MC3T3-E1细胞用2mmol/L NAC培养25h；NAC+MG组MC3T3-E1细胞用2mmol/L NAC预培养1h，再加入半数抑制浓度的MG培养24h。

4.细胞存活率检测：采用MTT法进行检测。取对数生长期的MC3T3-E1细胞，以105个/毫升的浓度接种于96孔板，培养24h后按不同分组处理后弃上清，换成无血清培养基，每孔加入20μl 5mg/ml的MTT，37℃、5%CO2培养箱避光培养4h。小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μl DMSO，摇床上避光低速震荡10min使结晶完全溶解，酶标仪490nm检测吸光度值，实验重复3次。细胞存活率(%)=(各实验组吸光度值-调零孔吸光度值)/(对照组吸光度值-调零孔吸光度值)×100%。

5.细胞凋亡检测：采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双标记结合流式细胞仪以及TUNEL染色法进行检测。Annexin Ⅴ-FITC/PI法：将处理后的细胞消化收集，用预冷的结合缓冲液调整细胞密度至106个/毫升，室温避光加入Annexin Ⅴ-FITC，再加入PI，孵育10min后流式细胞仪检测细胞凋亡。TUNEL染色法将细胞爬片用4%多聚甲醛室温固定1h，再用通透液(体积分数0.1% Triton X-100和质量分数0.1%柠檬酸钠配成)2～8℃通透2min，PBS清洗后50μl反应液37℃避光孵育1h，用含有DAPI的封片剂封片，正置荧光显微镜观察拍照，计数300个细胞计算凋亡率。

6.蛋白表达检测：采用Western blot法检测。用含有PMSF的RIPA 裂解液充分裂解细胞，超声后高速离心机4℃ 12000r/min离心，上清液-80℃分装保存。采用BCA法测定蛋白浓度，并将各组蛋白浓度调至相同，加入上样缓冲液至蛋白终浓度为1μg/μl，100℃煮沸10min使蛋白充分变性。配制5%浓缩胶以及12%分离胶，每孔上样20μg蛋白， SDS-PAGE电泳分离后湿转法将蛋白电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，将膜分别转入含一抗的稀释液中(MCU 1∶2000，β-actin 1∶3000)，4℃孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育1h，化学发光成像仪曝光，扫描图像并用Image J 软件分析灰度。

结 果

1.MG对成骨细胞增殖活性的影响：与对照组比较，不同浓度的MG(100、200、300、400、500、600、700、800、900μmol/L)处理24h后均能抑制成骨细胞增殖活性，并随着MG浓度增加抑制率升高，呈浓度依赖性。MTT结果显示，600μmol/L的MG处理细胞24h后细胞活性为50.86%，达到半数抑制率，故后续实验采用该浓度作为给药条件(图1)。

图1 不同浓度MG对成骨细胞增殖的影响与对照组比较，*P<0.05

2.MG对成骨细胞凋亡的影响：流式细胞术结果显示，用半数抑制浓度MG处理的成骨细胞总凋亡率为39.02%，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05，图2A、图2B)，提示MG诱导成骨细胞凋亡。此外，在同样的处理条件下TUNEL染色结果显示，与对照组比较，MG处理组染色阳性率为32.48%(P<0.05，图2C、图2D)，显著多于对照组，这进一步验证了MG处理后MC3T3-E1细胞的死亡类型以凋亡为主。

图2 MG对成骨细胞凋亡的影响A、B.流式细胞术，左上象限为坏死细胞，左下象限为正常细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞；C、D.TUNEL染色(×200)；与对照组比较，*P<0.05

3.MG对MCU蛋白表达的影响：与对照组比较，600μmol/L的MG处理MC3T3-E1细胞24h后MCU蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 MG对MCU蛋白表达的影响A.Western blot法检测MCU蛋白表达变化；B.MCU蛋白与β-actin比较；与对照组比较，*P<0.05

4.ROS在MG诱导成骨细胞凋亡中的作用：TUNEL结果证实，NAC预处理后细胞阳性染色率较MG组显著减少，细胞凋亡减少。此外，Western blot法检测结果表明，与MG组比较，NAC处理后MCU蛋白表达水平减少，差异有统计学意义(P< 0.05，图4)。

讨 论

牙周炎是发生在牙支持组织的由牙菌斑中的微生物所引起的慢性感染性疾病，可导致牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收，最后可致牙松动甚至脱落，是中国成人失牙的首位因素。目前，牙周炎与全身系统性疾病间的相互影响已经成为牙周医学的研究热点。其中，糖尿病作为严重影响人类健康的三大疾病之一，与牙周炎存在双向关系，两者发病存在共同危险因素且互为高危因素。据统计，全球已有4.25亿成年人患有糖尿病，而糖尿病患者得牙周炎概率高于正常者约20%，并且牙周组织破坏更显著以及疾病发展更迅速[5]。糖尿病病理条件下，牙周基质产生细胞如成纤维细胞以及成骨细胞凋亡增加，进一步限制了牙周软组织和骨组织的愈合，而牙槽骨破坏是牙周炎的重要病理特征，是造成牙齿松动和脱落的直接原因[2, 6]。因此，深入研究糖尿病牙周炎中成骨细胞凋亡机制，为减少牙槽骨吸收提供理论依据，具有积极的临床意义。

图4 ROS在MG诱导成骨细胞凋亡中的作用A.MTT检测细胞存活率；B、C.TUNEL染色(×200)；D、E.Western blot法检测MCU蛋白表达变化；E.MCU蛋白与β-actin比较；与对照组比较，*P<0.05

MG属于α-酮基醛类，由糖酵解的中间产物丙糖磷酸化裂解生成，或由丙酮和氨基丙酮代谢生成，是一种有毒的代谢产物。糖尿病高糖环境下，细胞和血浆中MG升高并长期处于较高状态。已有研究证实MG能直接或者间接通过糖基化反应作用于细胞，诱导细胞应激反应，损伤胰岛细胞降低其降糖作用，与糖尿病的进程及各项并发症息息相关。此外，Kashket等[3]研究发现MG是牙周炎重要致病菌福赛类杆菌的产物，其浓度在牙周炎患者龈沟液中明显高于正常者。Settem等[7]研究证实MG能诱发牙周组织的炎性反应。Retamal等[8]研究发现MG能够诱导牙龈成纤维细胞凋亡。牙周炎患者龈沟液中MG的浓度可高达23mmol/L，本研究采用的半数抑制浓度600μmol/L远低于该生理浓度，根据MTT结果以及流式细胞术、TUNEL凋亡染色证实，该浓度能够诱导成骨细胞凋亡，符合既往研究结果。

近年来，ROS与糖尿病牙周炎的关系已成为研究热点。ROS是指含氧自由基，主要是线粒体呼吸链电子传递时产生，同时，细胞本身具有复杂的抗氧化防御系统与之抗衡，当这种平衡失调ROS水平升高时，氧化应激形成。研究证实，糖尿病牙周炎患者牙周组织中ROS水平增加，并且与牙周炎附着丧失的严重程度呈正相关[9]。NAC作为经典的抗氧化剂，能够清除细胞中的活性氧，其可以明显缓解MG对成骨细胞活性的抑制，而其单独处理对细胞并无影响。此外，糖尿病患者血清ROS增加，自身抗氧化能力下降也间接增加活性氧水平和活性氧对牙周组织的损害，而牙周基础治疗在改善牙周炎症的同时伴随着血清ROS的降低。线粒体作为细胞内ROS的主要来源，也是ROS攻击的主要靶点[10]。

Sun等[2]研究发现，线粒体ROS增加、功能障碍和线粒体生理失衡是导致糖尿病牙周炎加重的发病机制。线粒体钙单向转运蛋白位于线粒体内膜，可顺电化学梯度摄入Ca2+， 将Ca2+从胞质转运到线粒体基质并控制转运速率，Ca2+通过MCU进入线粒体, 激活线粒体内脱氢酶和ATP合成酶, 从而调节氧化磷酸化。已有研究证实，在构建H2O2氧化应激损伤模型中，MCU通过Ca2+超载机制，诱导HeLa细胞、小脑神经元细胞凋亡，而使用MCU阻断剂改善了NSC34细胞系的氧化应激损伤，这说明ROS可能通过MCU诱导细胞凋亡[11，12]。此外，MCU与2型糖尿病胰岛素抵抗以及糖尿病小鼠心脏功能密切相关[13，14]。Liu等[15]研究发现，MCU介导体外高糖诱导的人神经母细胞瘤细胞的凋亡，并且与ROS相关。而MCU是否介导糖尿病牙周炎中成骨细胞凋亡目前未见相关研究。本研究中，MG在诱导成骨细胞凋亡的同时伴随着MCU蛋白表达的显著增加，说明MCU在该过程中发挥了重要作用。为了进一步探讨ROS与MCU的相关性以及在成骨细胞凋亡中的作用，本实验采用经典抗氧化剂NAC进行干预，其能有效清除细胞内ROS，如图4所示，MTT以及TUNEL染色结果显示NAC不仅有效地缓解了MG对成骨细胞增殖活性的抑制，同时减少了细胞凋亡，此外，同样的处理条件下MCU蛋白表达水平下降，而NAC单独处理并没有影响，这说明MG很可能是通过上调ROS水平，经MCU调控诱导成骨细胞凋亡。

综上所述，本研究认为MG能够诱导成骨细胞凋亡，其作用机制可能是通过激活ROS-MCU途径来实现的，这将为进一步探索以MCU为靶点防治糖尿病性牙周炎牙槽骨吸收提供分子生物学依据。