董雅璐 张 军

AntitumorActivityofOncolyticVirusesExpressingIL-15inGastricCancer.DongYalu,ZhangJun.DepartmentofOncology,GeneralHospitalofXinjiangMilitaryRegion,Xinjiang830000,China

AbstractObjectiveTo explore the antitumor activity of VSV Δ 51 oncolytic virus expressing IL-15 in gastric cancer.MethodsThe sequence of mouse IL-15 gene was obtained and integrated into the skeleton of VSV Δ 51 oncolytic virus to obtain VSV Δ 51/IL-15 oncolytic virus. The oncolytic activity of tumor cells was verified by infecting tumor cells in vitro. At the same time, VSV Δ 51/IL-15 was given to the tumor xenograft model in vivo. The anti-tumor activity of VSV Δ 51/IL-15 was reflected by the tumor inhibition ability test, immunohistochemical analysis of T cell infiltration and flow analysis of anti-tumor immune activation of infiltrating T cells.ResultsVSV Δ 51/IL-15 oncolytic virus was constructed and obtained. In vitro experiments showed that it could effectively infect tumor cells and express IL-15(P<0.01), it could also lyse tumor cells in a dose-dependent manner. The anti-tumor experiment of the tumor xenograft model showed that VSV Δ 51/IL-15 could significantly inhibit tumor growth(P<0.01) and reduce the mitotic ability of tumor cells. Immunohistochemical results showed that VSV Δ 51/IL-15 could significantly enhance T cell infiltration(P=0.000), while flow cytometry showed that tumor infiltrating T cells treated with VSV Δ 51/IL-15 had stronger anti-tumor activity(P=0.000).ConclusionVSV Δ 51/IL-15 can significantly inhibit the growth of gastric cancer cells and enhance anti-tumor immune response, which may provide a new strategy for the treatment of gastric cancer.

KeywordsGastric cancer; Oncolytic virus; IL-15; Immunotherapy

胃癌是一种起源于胃黏膜的恶性肿瘤。2013年约有98.4万新胃癌病例和84.1万人死亡。由于早期缺乏明显和特异的症状，大多数胃癌患者被诊断为疾病晚期，预后较差[1～3]。溶瘤病毒疗法近年来被证明是一种有希望的癌症免疫疗法[4,5]。FDA已经批准T-VEC (talimogene laherparepvec,一种溶瘤疱疹病毒)治疗转移性黑色素瘤，使得使用其他溶瘤病毒作为癌症的标准治疗成为可能[6]。水泡性口炎病毒(VSV)是来自Rhabdoviridae家族的一种包膜负义链RNA病毒，是一种典型的溶瘤病毒，在临床前模型中已经证明具有强大的溶瘤活性，正在进行临床试验评估其抗肿瘤活性[7,8]。通过对VSV定点突变可以使其在不损害健康细胞的情况下优先靶向肿瘤。例如，VSVΔ51通过缺失51位甲硫氨酸，提高了其肿瘤特异性，破坏了其在正常细胞中的复制[9]。既往的研究也表明，溶瘤病毒联合系统性增强抗肿瘤免疫活性的疗法会产生更好的抗肿瘤效果[10]。人白细胞介素-15(IL-15)是免疫细胞，如T细胞及NK细胞激活、扩增、分化和发挥免疫功能所必需的[11]。这些细胞因子在肿瘤微环境中含量往往较低，使得免疫细胞促生存信号被阻断，导致免疫活性降低[12]。

本研究通过基因工程的手段，使得VSVΔ51可以表达IL-15，获得了增强型的VSVΔ51/IL-15工程化溶瘤病毒。通过体外感染胃癌细胞，检测其肿瘤细胞毒性。同时通过体内抗肿瘤实验证明，VSVΔ51/IL-15可以显著抑制胃癌生长，增强抗肿瘤免疫活性，为胃癌的治疗提供了新的策略。

材料与方法

1.细胞系及主要试剂：人胃癌细胞MGC803及AGS由中国科学院上海细胞库提供，鼠胃癌细胞MFC细胞及Vero细胞由美国模式菌种保藏库提供。以上细胞均培养在添加10% FBS的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2条件下生长。MTT及二甲亚砜购自美国Sigma公司，anti-CD8、anti-IFN-γ及anti-TNF-α流式抗体购自美国Biolegend公司，anti-CD8、anti-CD4及anti-mIL-15抗体购自英国Abcam公司。Fix/Perm溶液及Perm/Wash 溶液购自美国BD Biosciences公司。

2.病毒的生产：鼠IL-15的序列获取自GenBank，并由苏州金唯智公司进行全基因合成。VSVΔ51病毒由John Bell博士和David Stojdl博士(渥太华健康研究所)提供。mIL-15通过XhoⅠ和XbaⅠ 酶切位点从载体上切割下来，克隆进VSVΔ51病毒G蛋白的3′端获得VSVΔ51/IL-15。VSVΔ51/IL-15在Vero细胞中增殖，并且通过先前描述的Vero细胞上的标准空斑分析方法定量病毒效价[13]。

3.靶细胞存活实验：MFC、MGC803、AGS细胞分别接种在96孔板中，每孔3000个细胞，加入0.1ml培养基中。分别按照MOI值为0.05、0.1、0.5、1、5加入VSVΔ51/IL-15处理后，向细胞中加入噻唑蓝[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium](1mg/ml终浓度)，在37℃继续培养3h。去除含MTT的培养基，将MTT沉淀物溶解于100μl二甲基亚砜中。使用微板酶标仪(iMark，美国Bio-Rad公司)在570nm处测定吸光度。细胞存活率(%)=[A570(实验组)/A570(对照组)]×100%。

4.Western blot法检测实验：在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解细胞。通过12% SDS-PAGE凝胶分离等量的蛋白质。电泳后将蛋白质转移至PVDF膜，在5%脱脂乳中封闭，并在4℃下与一抗(1∶1000)孵育过夜。用TBST洗涤3次后，将膜与HRP缀合的山羊抗兔或抗小鼠二抗(1∶10000)在室温下孵育2h。再用TBST再次3次洗涤后，根据制造商的方案，用增强型化学发光分析试剂盒对PVDF膜进行处理。用ChemiDocTMXRS+成像系统进行曝光。通过使用Image J对条带的强度进行量化。GAPDH用作加载对照。

5.HE染色：肿瘤组织切片后浸泡在10%甲醛溶液中，石蜡包埋后进行苏木精-伊红染色。在倒置显微镜下的明场下观察并拍照。比较各组的组织结构和有丝分裂细胞。

6.免疫组织化学染色：肿瘤组织的石蜡切片在二甲苯中脱蜡，在降低浓度的乙醇中水合，在0.3% H2O2-甲醇溶液中浸泡30min，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，在4℃用CD4和CD8单克隆抗体孵育过夜。洗涤后，将切片与生物素标记的山羊抗兔或抗鼠IgG在室温下孵育2h。免疫染色用链霉亲和素/过氧化物酶复合物和二氨基联苯胺显色，切片用苏木精复染。在倒置显微镜下的明场下观察并拍照。

7.流式细胞术检测肿瘤浸润T细胞：细胞表面染色使用anti-CD8抗体, 细胞用PBS溶液洗涤后与抗体避光孵育20min，使用PBS洗涤3次后进行细胞内抗原染色，用于检测干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。细胞在Fix/Perm溶液中(美国BD Biosciences公司)固定后，用Perm/Wash Buffer(美国BD Biosciences公司)洗涤，然后使用抗体细胞内染色30min，Perm/Wash Buffer洗涤后进行流式分析。所有样本在LSR Ⅱ细胞仪(BD)上进行操作，并用FACS DIVA软件v8.0(美国BD Biosciences公司)进行分析。

8.体内实验： 6周龄左右的雌性C57BL/6小鼠购自卡文斯医学动物有限公司。对于胃癌皮下异种移植模型，将MFC(2×106个/鼠)细胞接种于6周龄雌性C57BL/6小鼠的后侧皮下。3天后，可触及的肿瘤已经形成(约50mm3)，小鼠随机分为两组。6天后，143B细胞肿瘤的平均体积达到约150mm3。在6～8天和12～14天将VSVΔ51/IL-15溶瘤病毒[2.5×107pfu/(kg·d)]瘤周注射。每7天测量肿瘤长度和宽度，按公式(长×宽2)/2计算体积。接瘤后第28天处死小鼠将肿瘤剥离，称量瘤重并拍照。本研究由笔者医院动物伦理与福利委员会批准。

结 果

1.VSVΔ51/IL-15对肿瘤细胞的感染：荧光显微镜观察结果表明(图1)，VSVΔ51/IL-15可以有效感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中表达绿色荧光蛋白。将感染后的细胞裂解，Western blot法检测结果表明，VSVΔ51/IL-15感染的肿瘤细胞IL-15的表达量显著增加(t=6.885，P<0.01)。

图1 VSVΔ51/IL-15感染肿瘤细胞A.MOI值为5时VSVΔ51/IL-15感染细胞后的荧光显微镜结果(×10)；B、C.细胞感染VSVΔ51/IL-15后的Western blot法检测结果

2.VSVΔ51/IL-15对肿瘤细胞的细胞毒性：使用不同MOI的VSVΔ51/IL-15分别感染多种胃癌细胞，MTT实验结果表明(图2)，随着MOI值的增加，VSVΔ51/IL-15对小鼠胃癌细胞MFC细胞的靶细胞毒性逐渐增强。同样的，感染人胃癌细胞MGC803及AGS的MTT结果也显示，随着VSVΔ51/IL-15浓度增加，对靶细胞的裂解能力增强。

图2 VSVΔ51/IL-15对靶细胞的细胞毒性A.胃癌细胞MFC;B.胃癌细胞MGC803;C.胃癌细胞AGS

3.VSVΔ51/IL-15在体内抑制小鼠胃癌肿瘤的生长：在小鼠胃癌移植瘤模型中，肿瘤的瘤体积生长曲线结果表明(图3)，VSVΔ51/IL-15较对照组而言，可以有效抑制肿瘤的生长(t=12.36，P<0.01)。处死小鼠剥离肿瘤后，瘤重结果也表明VSVΔ51/IL-15治疗后的小鼠，肿瘤质量显著降低(t=10.75，P=0.000)。此外，来自肿瘤的组织学检查发现，对照组的肿瘤有很高比例浓缩的深紫色细胞核的存在，表明癌细胞有丝分裂旺盛，然而，与对照组比较，用VSVΔ51/IL-15治疗的小鼠的肿瘤中有丝分裂细胞的数量显著减少。

图3 VSVΔ51/IL-15的体内抑瘤活性A.接受VSVΔ51/IL-15治疗后监测肿瘤体积；B.两个治疗组的肿瘤照片；C.肿瘤重量结果; D. HE染色结果；两组比较，*P<0.01,**P=0.000

4.VSVΔ51/IL-15感染对T细胞浸润的影响：对瘤组织进行免疫组织化学染色(图4)，在VSVΔ51/IL-15治疗的小鼠中，肿瘤组织中有更多的CD4(t=49.16，P=0.000)及CD8(t=30.84，P=0.000)T细胞浸润，而在对照组小鼠中，肿瘤中未见T细胞浸润。

图4 肿瘤浸润淋巴细胞的免疫组化分析A.肿瘤浸润淋巴细胞的免疫组化照片(×10)；B.CD4+T细胞数；C.CD8+T细胞数

5.VSVΔ51/IL-15感染对CD8+T细胞功能的影响：取小鼠肿瘤组织，对其中浸润的CD8+T细胞进行流式分析(图5)，结果表明，VSVΔ51/IL-15治疗后的小鼠肿瘤中，CD8+T细胞具有高的IFN-γ+(t=19.24，P=0.000)及TNF-α+(t=31.18，P=0.000)的T细胞占比，而对照组小鼠肿瘤中，IFN-γ+及TNF-α+T细胞的占比很低。以上结果表明，VSVΔ51/IL-15治疗后可以显著增强肿瘤浸润T细胞的效应功能，从而发挥更好的抗肿瘤活性。

图5 流式分析肿瘤浸润淋巴细胞的免疫活性A.流式分析肿瘤浸润淋巴细胞的的代表性图片；B. IFN-γ+T细胞数目；C. TNF-α+T细胞数目

讨 论

胃癌是世界第4大常见恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的第3大原因。尽管早期胃癌患者可受益于化疗及靶向治疗药物，但原发性耐药或获得性耐药最终导致胃癌患者治疗失败和预后不良[14，15]。因此需要新的治疗策略来应对这一挑战。

VSV具有选择性感染肿瘤细胞的能力，而对正常细胞的感染能力有限[16]。由于VSV的肿瘤治疗潜力，已经有越来越多的临床前研究探索其在实体瘤中的应用，使其成为一种很有前途的溶瘤病毒[17]。VSV现在已被证明对恶性胶质瘤、黑色素瘤、肝细胞癌、乳腺癌有效[18]。通过对VSV定点突变可以使其在不损害健康细胞的情况下优先靶向肿瘤。例如，VSVΔ51通过缺失51位甲硫氨酸，提高了其肿瘤特异性，破坏了其在正常细胞中的复制[9]。由于该病毒已被证明对癌细胞具有高度选择性，先前的一项研究证实，VSV是一种在肿瘤部位表达和传递外源基因的有效载体[8]。越来越多的人正在研究使用重组VSV携带各种不同类型基因的肿瘤治疗潜力。本研究构建了携带IL-15基因的VSVΔ51/IL-15工程化溶瘤病毒。体外证明其可以有效感染并裂解肿瘤细胞。体内实验也证明，这种工程化溶瘤病毒可以显著抑制胃癌细胞的生长，同时增强小鼠自身抗肿瘤免疫反应。

IL-15是一种很有前途的治疗实体肿瘤的细胞因子。IL-15优先刺激NK和CD8+T细胞的激活、增殖、存活和细胞毒性，包括调节记忆CD8+T细胞的稳态增殖和存活[19]。IL-15具有与IL-2相似的受体结合、生物学活性。然而，与IL-2比较，IL-15不会诱导T细胞活化诱导细胞死亡(AICD)，也不会促进免疫抑制的CD4+T调节细胞(Treg)的增殖或分化。因此，考虑到IL-15激活效应免疫细胞的能力，IL-15有可能成为优于IL-2的癌症治疗药物[20]。

近期开展的其他研究也评估了将细胞因子与溶瘤病毒疗法结合使用，试图提高肿瘤杀伤率。这些研究表明，将两种不同的治疗策略结合起来治疗小鼠肿瘤具有协同效应。溶瘤病毒对癌细胞有直接的细胞毒性作用，而细胞因子则产生免疫刺激的抗癌作用。这也使得有研究人员改造溶瘤病毒，使其表达细胞因子，从而更好的抑制肿瘤[21]。这种新的治疗方法可以单独使用或联合其他疗法，如化疗或放疗，对复发性非手术的癌症治疗可能有效。病毒溶瘤和免疫治疗之间的这种协同关系在癌症的治疗中很有希望，值得进一步研究，以阐明增强抗肿瘤效果的潜在免疫机制。未来的研究可以将VSVΔ51与其他免疫刺激细胞因子(GM-CSF、IL-12等)联合使用，验证在胃癌中的抗肿瘤能力。总之，VSVΔ51/IL-15可能成为胃癌治疗新的手段之一。